參與初情期啟動的山羊卵巢miRNA篩選與鑒定.pdf

1、初情期是動物首次發(fā)情并排卵的時期，是動物開始獲得繁殖力的一種標(biāo)志，闡明初情期啟動機制對于畜牧學(xué)和醫(yī)學(xué)均具有重大意義。MicroRNAs（miRNA）是普遍存在于真核生物中的非編碼RNA，可通過堿基互補配對方式與靶基因的mRNA結(jié)合，導(dǎo)致其降解或抑制其翻譯。有證據(jù)顯示 miRNA參與了動物初情期的調(diào)節(jié)。為揭示miRNA介導(dǎo)在山羊初情期啟動的機制，本研究采用公羊試情、外陰檢查，并結(jié)合卵巢組織學(xué)觀察的方法選取初情期前和初情期雌性黃淮山羊各3只

2、，采用新一代高通量測序和生物信息學(xué)分析技術(shù)對其卵巢miRNA進行了測序和比較，篩選出了可能參與調(diào)控初情期啟動的miRNA，并對候選靶基因進行了GO（Gene Ontogy）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genoms）通路分析，試驗結(jié)果如下：
　?。?）從卵巢組織學(xué)結(jié)構(gòu)看出，初情期前和初情期卵巢皮質(zhì)上均有不同發(fā)育時期的卵泡，但無黃體；而初情期卵巢皮質(zhì)中卵泡較大，卵泡內(nèi)充滿大量的顆

3、粒細胞。
　?。?）6個小RNA（small RNA,sRNA）文庫高通量測序后，原始序列（raw reads）經(jīng)去接頭、去污染和去低質(zhì)量等凈化過程后，初情期3個樣P_1、P_2和P_3文庫中得到的純凈序列（clean reads）分別為13773420、15120274和12113416，占rawreads比例分別為98.17％、98.05%和98.07%；初情期前3個樣Pb1、Pb2和Pb3文庫中得到的clean reads分

4、別為10101765、11611140和11276907，占rawreads比例分別為98.64%、97.42%和96.98%。
　?。?）篩選的sRNA長度主要集中在20~24 nt，以22 nt長度達到最大，在初情期3個文庫中分別占到49.87%、51.65%和49.73%；初情期前3個文庫中分別占到48.78%、48.39%和50.58%。
　?。?）與miRbase20.0數(shù)據(jù)庫比較，根據(jù)miRNA的成熟體及前體結(jié)果

5、，初情期和初情期前共篩選出已知保守的miRNA409個，預(yù)測的miRNA117個；差異表達的miRNA共489個，其中在初情期特異表達的miRNA有21個，在初情期前特異表達的miRNA有20個，在初情期與初情期前共表達的miRNA有448個。
　　（5）初情期與初情期前表達顯著差異的miRNA共篩選出30個，其中初情期較初情期前表達差異上調(diào)的miRNA有9個，表達差異下調(diào)的miRNA有21個。
　?。?）對潛在調(diào)控初情期啟

6、動的miRNA靶基因進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，miRNA靶基因參與了細胞代謝過程（cellular process）、膜（membrane）和結(jié)合（binding）等多種生物學(xué)過程；進行KEGG相關(guān)通路分析，結(jié)果 KEGG相關(guān)通路分析表明 miRNA靶基因參與多種信號通路，主要富集在嗅覺轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Olfactory transduction），其中GABA神經(jīng)遞質(zhì)的突觸傳導(dǎo)（GABAergic synapse）、催產(chǎn)素信號通路（Oxytoc

7、in signaling pathway）、促性腺激素釋放激素信號通路（GnRH signaling pathway）、雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）、cAMP信號通路（cAMP signaling pathway）、孕酮介導(dǎo)的卵母細胞成熟（Progesterone-mediated oocyte maturation）與減數(shù)分裂（Oocyte meiosis）等多個通路都可能與初情期啟動相關(guān)。<

8、br>　?。?）從差異表達的30個miRNA中隨機選擇7個（chi-miR-182、chi-miR-655、chi-miR-3955-5p、chi-miR-376c-3p、chi-miR-376e-3p、chi-miR-136-3p和chi-miR-423-5p），應(yīng)用實時熒光定量 PCR技術(shù)驗證本次試驗高通量測序結(jié)果的可靠性，結(jié)果顯示miRNA的表達水平和測序結(jié)果一致。
　　結(jié)論：本次高通量測序共篩選了初情期與初情期前的489個