靶向FGFR4的miRNA篩選及鑒定研究.pdf

1、目的：肝細胞癌（HCC）是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。然而，肝癌進展的詳細分子機制仍不完全清楚。惡性腫瘤的侵襲和遷移是其治愈率低、治療效果差的主要原因。MicroRNA（miRNA）是一類單鏈非編碼RNA分子，其存在于生理條件下并且長約19-25nt。它可以通過mRNA的編碼區(qū)或非翻譯區(qū)互補結(jié)合，直接與靶基因降解或抑制靶基因翻譯過程調(diào)節(jié)靶基因的表達，屬于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達一類分子。由于其作為基因調(diào)節(jié)因子的重要性，microRNA可以

2、在生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，例如生物體發(fā)育和腫瘤發(fā)生。成纖維細胞生長因子受體（FGFR）屬于免疫球蛋白基因超家族。它由胞外區(qū)、單次跨膜區(qū)和細胞質(zhì)內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)三個部分組成，可與成纖維細胞生長因子（fibroblast growthfactor，F(xiàn)GF）結(jié)合，通過各種不同的信號傳遞路徑，對細胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移進行調(diào)節(jié)。目前已克隆的FGF受體有FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR5，其分布具有組織特異性，F(xiàn)GFR

3、4是唯一存在于成熟靜息狀態(tài)肝細胞上的FGFR。成纖維細胞生長因子受體4（fibroblast growth factor receptor4，F(xiàn)GFR4）是成纖維細胞生長因子受體家族中較晚被發(fā)現(xiàn)的一類跨膜酪氨酸激酶受體。FGFR4通過與成纖維細胞生長因子結(jié)合，啟動Ras、PLC等多條信號轉(zhuǎn)導途徑，參與調(diào)控胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、血管生成、組織分化和修復等多種生理過程，在胚胎組織和一些生長活躍的組織內(nèi)中有著較高的表達，并且在許多腫瘤組織內(nèi)會出

4、現(xiàn)過表達，已成為癌癥前期極好的預測因子和基因治療的有效靶點。鑒于microRNAs（miRNAs）在腫瘤轉(zhuǎn)移中的至關(guān)重要的作用，我們的目的是分析一個被命名為miR-340的轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA在HCC中的表達和功能：（1）預測與FGFR4結(jié)合的miRNA，并篩選與FGFR4表達負相關(guān)的miRNA。（2）驗證此miRNA與FGFR4的3’-UTR的特異性結(jié)合。（3）研究miRNA表達對人肝癌細胞株生物學特性的影響。（4）考察miRNA在肝癌

5、及癌旁組織中的表達及與FGFR4表達的相關(guān)性。
　　方法：利用miRNA生物信息學預測數(shù)據(jù)庫分析，尋找肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA。利用RT-PCR檢測miR-340在病人的腫瘤組織和癌旁肝組織中以及肝癌細胞系中的表達。利用熒光素酶報告檢測實驗驗證作用于FGFR4的miRNA。利用慢病毒轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建miR-340過表達和低表達細胞系。利用western blot檢測FGFR4表達水平。利用transwell小室實驗檢測肝癌侵襲和遷移。

6、利用CCK-8法測定細胞凋亡。
　　結(jié)果：通過三個常用的miRNA生物信息學預測數(shù)據(jù)庫預測與FGFR4相互作用的miRNAs，我們得到3個miRNA：miR-330-5p，miR-340，miR-3613-5p。根據(jù)RT-PCR和前期Western blot的結(jié)果，我們選擇miR-340作為進一步研究的對象。成功構(gòu)建HepG2-miR-340up、Hep3B-miR-340down實驗組以及其相應的陰性對照空載體質(zhì)粒組。結(jié)合熒光素

7、酶報告實驗的結(jié)果，確認了miR-340可以與FGFR4特異性結(jié)合。通過慢病毒轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建miR-340過表達和低表達細胞系，通過western blot實驗，證明miR-340與FGFR4呈負相關(guān)。CCK-8結(jié)果表明，miR-340對于肝癌細胞的增殖具有一定的抑制作用。對肝癌病人癌組織石蠟切塊中miR-340的測定顯示，其肝癌病人中的表達量遠遠低于正常人，且肝癌區(qū)的表達量低于癌旁正常組織。
　　結(jié)論：成纖維細胞生長因子受體4（FG

8、FR4）表達在肝癌中顯著升高，其表達水平與多發(fā)結(jié)節(jié)、微血管侵襲、肝癌的總生存率和無病生存率高度相關(guān)。miR-340在肝癌細胞中的異常表達會在很大程度上影響FGFR4的表達。通過實驗，我們可以確認miR-340能夠與FGFR4特異性結(jié)合，并對FGFR4的表達具有調(diào)控作用。miR-340過表達顯著抑制FGFR4的表達，而miR-340低表達可使FGFR4表達升高，二者存在較為顯著的負相關(guān)性。這些研究結(jié)果共同證明miR-340可以靶向調(diào)控FG