抑制PRRSV增殖的miRNA的篩選.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)基因組全長(zhǎng)約15kb，包括九個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORFs）。由PRRSV所引起的豬繁殖與呼吸綜合征自報(bào)道以來(lái)，已經(jīng)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。微小核糖核酸(miRNAs)是一類長(zhǎng)度為18-23bp的非編碼RNA，可作為一種調(diào)控物質(zhì)在轉(zhuǎn)錄后水平廣泛參與調(diào)控機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育等多種生命過(guò)程。
　　 PRRSV的遺傳多樣性等特點(diǎn)使得傳統(tǒng)疫苗的交叉保護(hù)力不足，為PRRS的防治帶來(lái)了不小的困難。而隨著研究的深入，

2、越來(lái)越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)具有抗病毒功能，并且miRNA可直接針對(duì)病毒基因保守區(qū)域發(fā)揮作用，因此對(duì)不同毒株均具有抗病毒作用。本研究以PRRSV的全基因組為模板，希望篩選到能顯著抑制PRRSV在細(xì)胞內(nèi)增殖的miRNA，從而為PRRS的防治提供新的依據(jù)。研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)方面:
　　 1.可能作用于PRRSV基因組的miRNA的預(yù)測(cè)和報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 本研究以PRRSV WuH3株全基因組為模板，將其提交到在線分析軟件

3、Targetscan，根據(jù)miRNA與靶基因的結(jié)合特點(diǎn)選擇了63條可能作用于PRRSV基因組的miRNA，由公司直接合成模擬物。同時(shí)，將PRRSV WuH3株ORFs克隆到載體pMIR-report上，成功構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒pMIR-WUH3-ORFs。
　　 2.抑制PRRSV增殖的miRNA的篩選
　　 將合成的miRNA模擬物與各報(bào)告質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，利用雙熒光素酶系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-let-7g/7a、

4、miR-3125、miR-379、miR-3165和miR-127-3p共6條miRNA分別能顯著抑制報(bào)告質(zhì)粒pMIR-WUH3-NSP2、pMIR-WUH3-ORF5、 pMIR-WUH3-3'UTR、 pMIR-WUH3-5'UTR、pMIR-WUH3-ORF2a/2b的活性。其中miR-let-7g和miR-3125分別能靶向PRRSVNSP2第2037-2061bp和ORF5第14104-14136bp的兩個(gè)保守區(qū)域。并且進(jìn)一步

5、通過(guò)Western-blot和空斑實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-let-7g和miR-3125顯著抑制PRRSV在Marc-145細(xì)胞中的增殖。
　　 3.miR-let-7g和miR-3125不調(diào)控IFN-β的表達(dá)
　　 為了探究miR-let-7g和miR-3125是否能調(diào)控IFN-β的表達(dá)，將miR-let-7g和miR-3125的模擬物和IFN-β啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，雙熒光素酶系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果表明m

6、iR-let-7g和miR-3125不能激活I(lǐng)FN-β啟動(dòng)子活性;進(jìn)一步檢測(cè)了miR-let-7g和miR-3125轉(zhuǎn)染細(xì)胞后上清對(duì)VSV-GFP增值的影響，結(jié)果顯示VSV-GFP增值滴度無(wú)顯著變化，說(shuō)明miR-let-7g和miR-3125不能促進(jìn)IFN-β的分泌，以上結(jié)果說(shuō)明miR-let-7g和miR-3125不參與調(diào)控IFN-β的表達(dá)。
　　 4.PRRSV感染抑制miR-let-7g和miR-3125的表達(dá)
　　

7、 為了探究miR-let-7g和miR-3125的表達(dá)是否受PRRSV感染的調(diào)控，本研究利用熒光定量RT-PCR檢測(cè)PRRSV感染Marc-145細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)miR-let-7g和miR-3125的表達(dá)量，結(jié)果顯示PRRSV感染Marc-145的前12h細(xì)胞內(nèi)miR-let-7g和miR-3125的表達(dá)顯著降低，miR-let-7g表達(dá)量在PRRSV感染36h后恢復(fù)到和對(duì)照組一致，miR-3125的表達(dá)量則在PRRSV感染2