miRNA-Dextran納米系統(tǒng)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的研究及Brachyury對脊索瘤臨床預(yù)后的預(yù)測價值.pdf

1、本文對miRNA-Dextran納米系統(tǒng)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的研究及Brachyury對脊索瘤臨床預(yù)后的預(yù)測價值進(jìn)行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：miRNA-Dextran納米系統(tǒng)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的研究。骨肉瘤（Osteosarcoma）是最常見的骨骼惡性腫瘤，多于兒童和青少年發(fā)病。骨肉瘤進(jìn)展快，侵襲性強(qiáng)，可經(jīng)血液轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，行新輔助化療保肢術(shù)后5年存活率70％左右。目前，以手術(shù)為主全身性化療為輔的綜合治療是骨肉

2、瘤的主要治療手段，但這種治療無法將癌細(xì)胞完全清除，骨肉瘤細(xì)胞的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移不能真正被控制，給患者造成了沉重的身心痛苦與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在全身化療中，藥物抵抗、計量限制性毒性嚴(yán)重限制了化療藥物的應(yīng)用。因此，臨床希望有更有效的治療策略來改善骨肉瘤的治療。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）在腫瘤診斷和治療中的作用越來越受到關(guān)注。miRNA是一組非編碼小RNA，與腫瘤的形成、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、凋亡和藥物抵抗均有關(guān)。成熟的miRNA結(jié)合于靶基因

3、的3’非翻譯區(qū)（3’UTR），其作用是抑制基因的表達(dá)和信使RNA(messenger RNA,mRNA)的轉(zhuǎn)錄。有大量研究報道m(xù)iRNA與腫瘤密切相關(guān)，包括骨肉瘤。課題組前期利用miRNA芯片和聚類分析發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤中異常表達(dá)的幾種miRNA，其中miR-199a-3p的表達(dá)在骨肉瘤細(xì)胞系中降低最明顯。將miR-199a-3p轉(zhuǎn)染至骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)可以顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長和增殖。另一個抑瘤性miRNA，let-7a，被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中的表

4、達(dá)下降。相應(yīng)的，重建let-7a表達(dá)可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。因此，轉(zhuǎn)染外源性miRNA進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，為多種腫瘤的有效治療提供了可能。雖然，以miRNA為基礎(chǔ)的抗腫瘤策略已經(jīng)成為非常有前景的治療策略，但是傳遞miRNA進(jìn)入細(xì)胞依然存在很多問題，限制了這一治療策略的發(fā)展，例如：miRNA在細(xì)胞中是高度不穩(wěn)定的，核酸酶和有限的循環(huán)半衰期導(dǎo)致的核酸快速降解、分子量小導(dǎo)致血管內(nèi)清除速度過快、不能靶向到達(dá)腫瘤細(xì)胞等，故必須

5、借助有效的運載載體。已有研究證明病毒載體可以有效的運載miRNA進(jìn)入細(xì)胞，但是臨床試驗發(fā)現(xiàn)病毒載體具有更多的副作用，臨床治療更需要非病毒的可靠安全的運載系統(tǒng)?；诖?，以多聚納米粒子為基礎(chǔ)的運載系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)可用于腫瘤的靶向治療,其優(yōu)勢包括高轉(zhuǎn)染效率、靶向傳遞、易修飾、無毒、安全等。在課題組的前期研究中，我們運用Dextran作為起始物制作納米粒子獲得成功。因為Dextran的基礎(chǔ)聚合物是以葡聚糖為基礎(chǔ)的無毒物，葡聚糖已經(jīng)在臨床上用作血漿擴(kuò)充

6、劑使用多年，并且通過了國家食品和藥品監(jiān)督管理局的認(rèn)可。我們也證明了Dextran可以被脂鏈修飾，以形成親水納米粒子，易通過細(xì)胞膜。同時，我們證明了以 Dextran為基礎(chǔ)的納米粒子可以傳遞藥物和多藥耐藥基因MDR1的siRNA進(jìn)入不同的腫瘤細(xì)胞以克服藥物耐藥。上述研究提示以Dextran為載體的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)具有高效轉(zhuǎn)運和無毒的特性，可以被用于運載其它藥物或生物分子。但是，Dextran納米是否可以直接攜帶 miRNA進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，并不影響其

7、功能的發(fā)揮，還未見報道。
　　目的：驗證以Dextran為基礎(chǔ)的納米運載系統(tǒng)，可以攜帶miRNA（miR-199a-3p、let-7a）形成miRNA-Dextran納米系統(tǒng)，抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，為 miRNA-Dextran納米系統(tǒng)用于骨肉瘤的靶向治療提供實驗依據(jù)，為骨肉瘤的治療提供新的思路。
　　方法：⑴miRNA-Dextran納米的合成：由美國東北大學(xué)合成的納米材料，包括：5mg/mL(~2.5 mM)右旋糖酐硫醇

8、衍生物（dextran thiol）,5 mg/mL(~2.5 mM)右旋糖酐乙胺衍生物（dextran hexylamine）和5mg/mL(125μM)硫醇化聚乙二醇（PEG-thiol）。將溶解于無RNA酶純水中的納米材料和miRNA溶液按順序混合，充分溶解后真空抽干制成固體。測量Dextran納米粒子的粒徑和zeta電位。利用1000 Ultra高電壓透射電子顯微鏡獲取納米粒子的透射電子圖譜。⑵為尋找轉(zhuǎn)染效率最高的miRNA-D

9、extran納米，將納米材料 dextran hexylamine和dextran thiol按照不同質(zhì)量比例配置5種不同的納米粒子，采用Taqman探針法設(shè)計引物，結(jié)合real-time PCR法檢測5種不同納米粒子攜帶let-7a轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞U-2OS后，細(xì)胞內(nèi)let-7a mRNA的表達(dá)量。以攜帶入細(xì)胞let-7a量最多的納米粒子為最佳納米，用于后續(xù)實驗。⑶應(yīng)用熒光標(biāo)記的miRNA-Dextran納米系統(tǒng)轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞 KHOS

10、、U-2OS，采用熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后2h、4h、24h時miRNA的內(nèi)攝取情況，并在卵巢癌細(xì)胞SKOV3和SKOV3TR細(xì)胞中進(jìn)行驗證。⑷miRNA-Dextran系統(tǒng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后，提取細(xì)胞內(nèi)RNA，采用Taqman探針法進(jìn)行Real-time PCR，檢測 Dextran納米攜帶miRNA進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)miRNA的表達(dá)量。⑸采用Western blot法檢測miRNA-Dextran納米系統(tǒng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)miRNA靶

11、基因所表達(dá)的蛋白的量的變化，以及不同轉(zhuǎn)染時間和轉(zhuǎn)染濃度對其蛋白表達(dá)的影響。⑹采用MTT法檢測Dextran納米系統(tǒng)攜帶miRNA進(jìn)入骨肉瘤細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力的變化。
　　結(jié)果：①Dextran納米的平均粒徑為351.6±2.5nm。裝載miRNA的Dextran納米帶負(fù)電荷，其zeta電位為-25.3±7.47mV。②當(dāng)Dextran hexyl amine為5mg，Dextran thiol為5mg的配比時(命名為Nanopa

12、rticle2，NP2)，NP2納米可攜帶更多的let-7a進(jìn)入細(xì)胞。5種不同的納米粒子 NP1、NP2、NP3、NP4、NP5攜帶 let-7a的量均顯著低于商用試劑Lipofectamine RNAi MAX攜帶的let-7a的量，5種納米粒子分別與Lipofectamine RNAi MAX比較，P值均小于0.05。NP2與NP3比較沒有顯著差異性（P>0.05），但遠(yuǎn)高于NP1、NP4和NP5攜帶入的let-7a的量（P<0.0

13、5）。③攜帶綠色熒光的AF488-miR-199a-3p和攜帶紅色熒光的A546-let-7a分別與Dextran納米結(jié)合，形成帶熒光的miRNA-Dextran納米。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-Dextran納米與骨肉瘤細(xì)胞（U-2OS細(xì)胞和KHOS細(xì)胞）共同孵育2h后，即在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)熒光信號，并且熒光信號隨著孵育時間的延長而增強(qiáng)。同時，經(jīng)過核染色實驗顯示Dextran納米可將miRNA帶入細(xì)胞漿，而不是細(xì)胞核。同時利用卵巢癌細(xì)胞系SKOV3

14、和SKOV3-TR做對比，得到同樣的結(jié)果。④使用攜帶miR-199a-3p或 let-7a的Dextran納米分別轉(zhuǎn)染 U-2OS細(xì)胞48h后，發(fā)現(xiàn)Dextran納米均可將上述兩種miRNA帶入U-2OS細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)這兩種miRNA的表達(dá)量明顯上升，miR-199a-3p-Dextran攜帶miR-199a-3p的量略低于Lipofectamine? RNAiMAX攜帶的量，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；但是let-7a-Dextran轉(zhuǎn)載的le

15、t-7a的量顯著低于使用商業(yè)試劑Lipofactmine? RNAimax攜帶的let-7a的量，P<0.05。⑤在U-2OS和KHOS細(xì)胞內(nèi)，使用miR-199a-3p-Dextran納米同樣可以抑制Met和mTOR蛋白的表達(dá)，抑制效果略低于使用Lipofectamine? RNAiMAX轉(zhuǎn)染。在抑制 Met蛋白表達(dá)方面，miR-199a-3p的效果略低于使用Met的siRNA轉(zhuǎn)染。IGF-1R為let-7a的靶蛋白，在U-2OS和K

16、HOS細(xì)胞內(nèi)，使用let-7a-Dextran納米同樣可以抑制 IGF-1R蛋白的表達(dá)，抑制效果略低于使用Lipofectamine? RNAiMAX轉(zhuǎn)染。隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，靶蛋白Met和mTOR的表達(dá)量越來越高，即miR-199a-3p抑制靶蛋白的功能越來越弱。采用不同轉(zhuǎn)染濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)隨著 miR-199a-3p-Dextran納米濃度越高，Met和mTOR的表達(dá)越弱，即miR-199a-3p抑制靶蛋白的功能越強(qiáng)。⑥MTT結(jié)

17、果顯示：裝載miRNA的Dextran納米轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可有效降低KHOS和U-2OS細(xì)胞的增殖。在轉(zhuǎn)染72h后，細(xì)胞增殖出現(xiàn)明顯差異。且在所有細(xì)胞和兩個不同miRNA中，100nM的miRNA-Dextran對細(xì)胞增殖的抑制作用均強(qiáng)于50nM的miRNA-Dextran。
　　結(jié)論：miRNA-Dextran納米系統(tǒng)可以有效的將miR-199a-3p和let-7a帶入骨肉瘤細(xì)胞，起到抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的作用。
　　第二部分：

18、Brachyury對脊索瘤臨床預(yù)后的預(yù)測價值。脊索瘤是一種罕見的局部惡性侵襲的骨腫瘤，約占到所有骨性惡性腫瘤的1％-4％。脊索瘤總體預(yù)后較差，術(shù)后局部復(fù)發(fā)率高，患者多死于局部腫瘤病灶的反復(fù)復(fù)發(fā)。因此亟須尋找到特異的分子標(biāo)記物為脊索瘤的預(yù)后判斷提供有利的信息。Brachyury是T-box基因家族的表達(dá)產(chǎn)物，是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子。目前已發(fā)現(xiàn)Brachyury在80％的脊索瘤中都會有表達(dá)，近年來被認(rèn)為是診斷脊索瘤的特異性標(biāo)記物，但是它與脊索

19、瘤臨床預(yù)后的相關(guān)性還未被論述。組織芯片可以一次性檢測大量組織樣本并消除不同批次實驗帶來的誤差，具有高通量、準(zhǔn)確的特點，是研究不同組織中各種生物標(biāo)記物的良好工具。
　　目的：利用脊索瘤的組織芯片對Brachyury在不同疾病狀態(tài)的脊索瘤患者的表達(dá)進(jìn)行分析，探討B(tài)rachyury作為提示脊索瘤臨床預(yù)后分子標(biāo)志物的可能性。
　　方法：征集美國麻省總醫(yī)院骨科1941年至2010年期間，78例脊索瘤組織、7例脊索瘤癌旁正常組織和6例胚

20、胎脊索的存檔組織蠟塊用于制作組織芯片。所有病理結(jié)果在制作前均經(jīng)過2名病理醫(yī)生的再次確認(rèn)。78位患者的中位數(shù)年齡為59歲（31-87歲）。采用R&D Systems公司（美國）細(xì)胞和組織染色試劑盒，依照試劑盒說明進(jìn)行免疫組化染色。染色后的組織芯片經(jīng)2名病理醫(yī)生采用雙盲法讀片，對于不一致的讀片結(jié)果，再次判讀，直至取得一致結(jié)果，記錄在案。在良好的組織結(jié)構(gòu)和清晰的背景下，以細(xì)胞核內(nèi)顯現(xiàn)棕色為陽性結(jié)果。結(jié)果判讀采用陽性細(xì)胞計數(shù)法：0分，沒有核內(nèi)陽

21、性結(jié)果；1分，<30％細(xì)胞核內(nèi)染色陽性；2分，31％－60％細(xì)胞核內(nèi)染色陽性；3分，>30％細(xì)胞核內(nèi)染色陽性。所有結(jié)果采用Graphpad PRISM統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。各組間 Brachyury的表達(dá)差異采用獨立樣本秩和檢驗，Brachyury與臨床進(jìn)展及生存時間的關(guān)系采用Kaplan-Meier生存分析。
　　結(jié)果：⑴Brachyury蛋白陽性著色定位于細(xì)胞核內(nèi)，其染色呈淡黃、棕黃或棕褐色，其在脊索瘤組織中的陽性表達(dá)率為75.6

22、4％（59/78）。Brachyury在胚胎脊索組織中表達(dá)全部陽性。根據(jù)脊索瘤發(fā)生的位置，將脊索瘤分為活動脊柱組和骶尾骨組，發(fā)現(xiàn)兩組將Brachyury的表達(dá)有顯著性差異（P=0.027）。骶尾骨的陽性率85.71%(36/42)要高于活動脊柱陽性率57.14%(12/21)。但是不同年齡和不同性別間，Brachyury的表達(dá)沒有明顯差異（P>0.05）。⑵Brachyury在原發(fā)性脊索瘤的陽性率為23/29（79.31%），復(fù)發(fā)性脊索

23、瘤的陽性率為31/41（75..60%），遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移脊索瘤為5/8（62.5%）。原發(fā)性脊索瘤分別與復(fù)發(fā)性脊索瘤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移脊索瘤相比較，均未見明顯差異。⑶78例脊索瘤患者中有61例（78.20%）可追蹤到預(yù)后結(jié)局。其中位數(shù)生存時間為68.70個月（3.63-249.63月）。到追蹤結(jié)束，有27個病例因為此病死亡（DOD），有7例病例帶瘤生存（AWD），有23個病例無瘤存活（NED），4個病例因其他疾病死亡。Brachyury在無瘤生存、帶