小梅山豬初情期前后下丘腦差異表達(dá)基因的篩選與鑒定.pdf

1、目前，國(guó)內(nèi)外相關(guān)學(xué)者對(duì)各種動(dòng)物初情期的調(diào)控因子做了多方面的研究，闡明了類固醇激素、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)、體脂代謝信號(hào)等對(duì)下丘腦神經(jīng)元釋放GnRH的影響。但除了以上所述的調(diào)控因子對(duì)豬初情期啟動(dòng)有調(diào)節(jié)作用外，是否還存在未知調(diào)控基因，影響豬初情期的啟動(dòng)尚不清楚。本研究的目的是通過(guò)RT-PCR、差異顯示PCR( DDRT-PCR)、反向Northern(Reverse Northern)、熒光定量PCR(realtime PCR)等分子生物學(xué)技術(shù)

2、，對(duì)小梅山豬初情期前后下丘腦差異表達(dá)的未知基因進(jìn)行篩選、鑒定，并與其在不同生理發(fā)育階段的表達(dá)變化規(guī)律聯(lián)系起來(lái)，探索這些基因在豬初情期啟動(dòng)機(jī)制中的作用，為豐富動(dòng)物生殖機(jī)理和早熟品種選種選育提供理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 試驗(yàn)用初生、初情期、性成熟期純種小梅山母豬各3頭，取出生(0同齡)、初情期(70日齡)(I組)以及初情期(70日齡)、性成熟期(150日齡)(II組)各三頭小梅山豬下丘腦總RNA，各取10μl組成總RNA池30μ

3、l。共組成兩組、四個(gè)RNA池。采用10條錨定引物，10條隨機(jī)引物組成100種引物組合進(jìn)行DDRT-PCR，共獲得12條差異表達(dá)條帶，通過(guò)NCBI比對(duì)發(fā)現(xiàn)其中4條序列與已知基因高度同源，分別命名為MS01(355bp)，MS02(391bp)，MS03(241 bp)，MS04(281 bp)。MS01與豬腦特異性血管生成抑制因子(bpai)高度同源，同源性為98％，GenBank登錄號(hào)為XM_001925295。MS02與豬腦脂肪酸結(jié)合

4、蛋白基因(fabp7)有高度同源性，同源性為93％，GenBank登錄號(hào)為DQ000160。MS03與豬13號(hào)染色體上一段功能未知的序列同源，同源性為86％，GenBank登錄號(hào)為CU633348。MS04與人的膠原蛋白剪接變體有較強(qiáng)的同源性，同源性為95％，GenBank登錄號(hào)為DQ644568。其他序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中均無(wú)相同基因。 最后通過(guò)Reverse Northern、real time PCR定性和定量檢測(cè)各基因表達(dá)水平。

5、定量結(jié)果顯示：豬下丘腦三個(gè)發(fā)育階段中，bpai mRNA表達(dá)水平呈下調(diào)趨勢(shì)，并且初生時(shí)該基因的表達(dá)量與初情期以及性成熟期相比，差異表達(dá)顯著(P<0.05)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，下丘腦在出生至性成熟發(fā)育過(guò)程中，這一因子參與其中，為初情期時(shí)下丘腦神經(jīng)元的脈沖式釋放提供通路保障，起著管道迅速發(fā)育的導(dǎo)向作用；fabp7 mRNA在下丘腦三個(gè)不同發(fā)育階段中，表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢(shì)，差異表達(dá)不顯著(P>0.05)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，脂肪酸調(diào)節(jié)因子在小梅山豬中