文昌雞性成熟啟動(dòng)前后下丘腦部分功能基因和miRNA表達(dá)譜的變化.pdf

1、性早熟在人類上表現(xiàn)為病理狀態(tài)，而在家禽生產(chǎn)上則是一個(gè)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的性狀。我國(guó)地方雞品種資源的早熟特性十分明顯，開展雞性成熟調(diào)控機(jī)制研究，對(duì)于高產(chǎn)蛋雞和優(yōu)質(zhì)肉雞育種具有重要意義。同時(shí)，雞作為重要的模式生物，其早熟性相關(guān)研究也可為人類性早熟疾病臨床診斷、治療提供科學(xué)依據(jù)。
　　性成熟啟動(dòng)是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，決定性成熟啟動(dòng)的關(guān)鍵性事件是下丘腦GnRH脈沖式釋放增加。近年來研究發(fā)現(xiàn)，諸多功能基因和調(diào)節(jié)因子參與了性成熟啟動(dòng)，性成熟啟

2、動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄抑制可能起到了重要作用，防止了性成熟的過早發(fā)生;模式生物和哺乳動(dòng)物（包括人類）發(fā)育時(shí)機(jī)研究提示miRNA和性成熟啟動(dòng)之間有潛在聯(lián)系;進(jìn)入血液循環(huán)的外泌體所裝載的miRNA能在血清（漿）中穩(wěn)定存在，并且其拷貝數(shù)變化能反映機(jī)體生理和病理狀態(tài)改變，是一種新型生物標(biāo)志物。
　　本論文選取早熟地方雞品種文昌雞為實(shí)驗(yàn)素材，主要開展了以下幾個(gè)方面的研究:(1)測(cè)定不同發(fā)育時(shí)期文昌雞母雞雞冠、性腺組織的發(fā)育性變化和血清LH濃度變化，度

3、量文昌雞母雞的性成熟啟動(dòng)時(shí)機(jī)，為構(gòu)建性成熟啟動(dòng)前、后高通量測(cè)序文庫(kù)提供基礎(chǔ)。(2)利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了c-Myc/LIN28/let-7通路、POK/PcG/TRG通路部分功能基因在性成熟啟動(dòng)前、后文昌雞下丘腦中的表達(dá)變化規(guī)律。(3)利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了雞性成熟啟動(dòng)前、后下丘腦中miRNA表達(dá)譜，結(jié)合生物信息學(xué)分析，探討miRNA在雞性成熟啟動(dòng)調(diào)控中的作用。(4)利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了雞性成熟啟動(dòng)前

4、、后血清（漿）中miRNA表達(dá)譜，篩選差異表達(dá)miRNA，并利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)候選miRNA在性成熟啟動(dòng)及進(jìn)程中的表達(dá)規(guī)律，建立雞性成熟啟動(dòng)度量特異性循環(huán)miRNA標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)。
　　綜合本論文的研究結(jié)果，主要得出以下結(jié)論:
　　(1)性成熟啟動(dòng)時(shí)機(jī)度量
　　在發(fā)育早期，文昌雞雞性腺組織發(fā)育緩慢，卵泡保持原始狀態(tài)，這一過程約持續(xù)12周。12周齡后，性腺組織進(jìn)入快速發(fā)育期，13周齡母雞的卵巢重量(1.35g)和輸

5、卵管長(zhǎng)度(15.68cm)與12周齡測(cè)量值(0.60g、7.16cm)相比，分別增加了125％和120％，同時(shí)出現(xiàn)等級(jí)前小白卵泡（SWF，直徑1.0～2.0mm）或大白卵泡（LWF，直徑3.0～5.0mm)。LH水平的增加與性腺組織的快速發(fā)育相一致，LH水平在13周齡顯著增加(P＜0.01)，并在14～15周齡達(dá)到峰值，至開產(chǎn)后下降至較低水平。確定了13周齡為文昌雞母雞的性成熟啟動(dòng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)，這為構(gòu)建性成熟啟動(dòng)前、后高通量測(cè)序文庫(kù)提供了

6、前提。
　　(2)性成熟啟動(dòng)調(diào)節(jié)通路功能基因表達(dá)規(guī)律
　　qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)c-Myc、LIN28B基因在文昌雞性成熟啟動(dòng)關(guān)鍵時(shí)機(jī)（12周齡至13周齡）下丘腦組織中的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)，且c-Myc基因的低表達(dá)能夠持續(xù)到開產(chǎn)，而LIN28B基因表達(dá)水平在開產(chǎn)前（15周齡）又恢復(fù)至較高水平;與之相對(duì)應(yīng)的是，Solexa高通量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)性成熟啟動(dòng)后let-7a、let-7b和let-7g表達(dá)水平升高

7、。BCL6、ZBTB7A基因在性成熟啟動(dòng)前期下丘腦中的表達(dá)水平較低，性成熟啟動(dòng)后BCL6基因表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)，ZBTB7A基因表達(dá)水平雖有所升高，但與前期相比差異并不顯著(P＞0.05)，其表達(dá)水平的顯著性變化(P＜0.01)發(fā)生在15周齡，且在開產(chǎn)后仍維持較高水平。YY1、EED基因在性成熟啟動(dòng)前期下丘腦中的表達(dá)水平較高，性成熟啟動(dòng)后表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)，且這種低水平表達(dá)僅維持2～3周，15周齡后又恢復(fù)至較

8、高水平，并持續(xù)至開產(chǎn)。Oct-1基因在文昌雞性成熟啟動(dòng)前期下丘腦中的表達(dá)水平較低，性成熟啟動(dòng)后表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)，且至開產(chǎn)仍保持較高水平，而TT1基因表達(dá)水平在性成熟啟動(dòng)后顯著降低(P＜0.01)?？傮w上，研究結(jié)果支持基于哺乳動(dòng)物數(shù)據(jù)構(gòu)建的多層次等級(jí)基因調(diào)節(jié)通路模式，即c-Myc(↓)→LIN28(↓)┤ let-7(↑)，POK(↑)┤PcG(↓)┤TRG(↑)（→表示促進(jìn)作用，┤表示抑制作用），進(jìn)一步證實(shí)了該調(diào)控通路與

9、性成熟啟動(dòng)調(diào)節(jié)相關(guān)。推測(cè)通路調(diào)節(jié)功能在脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物（包括人類）進(jìn)化上是保守的，多層次等級(jí)基因轉(zhuǎn)錄抑制作用可能防止了性成熟的過早發(fā)生。
　　(3)性成熟啟動(dòng)前后下丘腦miRNA表達(dá)譜
　　通過高通量測(cè)序，在雞下丘腦中鑒定出374個(gè)已知miRNA、46個(gè)新miRNA，144個(gè)已知miRNA(reads＞10)的表達(dá)水平在性成熟啟動(dòng)前后發(fā)生了顯著改變(P＜0.05)。5個(gè)差異表達(dá)miRNA被qRT-PCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證。15

10、個(gè)差異最顯著miRNA(| log2(fold-change)|＞2.0，P＜0.01)預(yù)測(cè)到2013個(gè)靶基因，其中7個(gè)時(shí)鐘基因Per2、Bmal1/2、Clock、Cry1/2和Star被差異miRNA靶向多次，qRT-PCR檢測(cè)表明這些時(shí)鐘基因的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平在性成熟啟動(dòng)后下丘腦中顯著升高(P＜0.01)。GO富集和KEGG調(diào)節(jié)通路分析結(jié)果表明，這些差異表達(dá)miRNA在性成熟啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮了重要作用。表明miRNA是

11、參與雞性成熟啟動(dòng)新的調(diào)節(jié)因子。鑒于miRNA功能的保守性，該研究結(jié)果將為深入開展動(dòng)物（包括人類）性成熟的分子調(diào)控機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)。
　　(4)性成熟啟動(dòng)前后循環(huán)miRNA表達(dá)譜和循環(huán)miRNA標(biāo)記
　　通過高通量測(cè)序，在血清、血漿中鑒定出共表達(dá)miRNA192個(gè)，血清中特異性表達(dá)miRNA1個(gè)，血清中特異性表達(dá)miRNA4個(gè)，新發(fā)現(xiàn)miRNA19個(gè)(reads＞10)。針對(duì)同一miRNA，在相同發(fā)育時(shí)期血清、血漿中的

12、表達(dá)豐度基本一致。性成熟啟動(dòng)前、后血清中差異表達(dá)miRNA(P＜0.05)有130個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的有68個(gè)，下調(diào)的有62個(gè)。40個(gè)差異表達(dá)miRNA(|log2(fold-change)|＞1.0，P＜0.01）預(yù)測(cè)到4829個(gè)差異表達(dá)基因。GO富集和KEGG調(diào)節(jié)通路分析結(jié)果表明，這些差異表達(dá)miRNA主要參與蛋白水解、卵母細(xì)胞分裂、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)及基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄等通路。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，let-7a、miR-29c-3p、mi

13、R-217-5p、miR-375、miR-215-5p、miR-155、miR-9-5p、miR-19b-3p和miR-133a-3p等9個(gè)候選miRNA在性成熟啟動(dòng)時(shí)機(jī)（12至13周齡轉(zhuǎn)變）表達(dá)變化趨勢(shì)與Solexa測(cè)序結(jié)果基本一致。候選miRNA在性成熟啟動(dòng)前期血清中表達(dá)水平基本一致，就性成熟啟動(dòng)時(shí)機(jī)（12至13周齡轉(zhuǎn)變）而言，miR-29c-3p(p=0.000)、miR-375(p=0.002)、miR-215-5p(p=0.0

14、13)、miR-9-5p(p=0.034)、miR-19b-3p(p=0.008)、miR-133a-3p(p=0.006)和let-7a(p=0.002)的表達(dá)水平顯著升高，miR-217-5p(p=0.112)和miR-155(p=0.174)的表達(dá)水平并未發(fā)生顯著性變化，基于這7個(gè)候選miRNAs組成的特異性新型標(biāo)記可用于文昌雞性成熟啟動(dòng)時(shí)機(jī)的精確度量。鑒于miRNA功能的保守性，這些循環(huán)miRNA標(biāo)記可以為其它動(dòng)物性成熟啟動(dòng)度量