雞下丘腦食欲和能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的品種差異以及l(fā)eptin的程序化作用.pdf

1、本文首先通過比較蛋雞和肉雞下丘腦食欲(appetite)和能量穩(wěn)態(tài)(energyhomeostasis)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、糖皮質(zhì)激素受體(GR)、脂肪和肥胖相關(guān)(FTO)基因的表達(dá)在品種間存在差異。然后檢測了蛋雞和肉雞種蛋內(nèi)的激素水平，發(fā)現(xiàn)肉雞蛋內(nèi)含有較高的瘦素（leptin）和皮質(zhì)酮。根據(jù)以往的研究報(bào)道，提出蛋中l(wèi)eptin可能通過影響下丘腦食欲和能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)對后代生長性能產(chǎn)生程

2、序化影響。為驗(yàn)證這一假說，設(shè)計(jì)了蛋內(nèi)注射leptin及其拮抗劑的試驗(yàn)，觀察對內(nèi)雞早期生長發(fā)育影響的同時(shí)，下丘腦食欲和能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的變化，為揭示母源性leptin對禽類生長程序化影響的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　1.蛋雞和肉雞下丘腦食欲和能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的比較研究
　　蛋雞和肉雞在體重和身體組成上存在明顯的差異，而這種差異形成的機(jī)制還不清楚。本試驗(yàn)通過對出雛后7日齡(D7)蛋雞和肉雞的比較發(fā)現(xiàn)，肉雞具有較高的體

3、重和采食量(P＜0.001)，但單位體增重的采食量（飼料轉(zhuǎn)換比，F(xiàn)CR）反而蛋雞較高(P＜0.001)。采用原位雜交和（或）real-time RT-PCR的方法發(fā)現(xiàn)下丘腦中的一些基因如神經(jīng)肽Y(NPY)、刺鼠相關(guān)蛋白(AGRP)、阿黑皮素原(POMC)、食欲素(ORX)、leptin受體(LEPR)和20-羥基類固醇脫氫酶(20HSD)的mRNA表達(dá)在品種間都沒有顯著差異(P＞0.05)。下丘腦的乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和脂肪酸合酶

4、(FAS)的mRNA表達(dá)量肉雞有高于蛋雞的趨勢(P＜0.10)。肉雞下丘腦中CRH mRNA(P＜0.05)的表達(dá)較蛋雞低，但蛋白水平正好相反(P＜0.01)，表明CRH在轉(zhuǎn)錄、翻譯和分泌等不同水平的調(diào)節(jié)過程中存在差異。肉雞下丘腦中GR mRNA(P＜0.05)和蛋白（P＜0.01）水平均顯著高于蛋雞，說明肉雞下丘腦中由GR介導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)CRH轉(zhuǎn)錄和釋放功能的增強(qiáng)。此外，F(xiàn)TO基因在肉雞的下丘腦中高表達(dá)(P＜0.01)。以上結(jié)果揭示了

5、與能量平衡和肥胖相關(guān)的基因如GR、CRH、FTO的表達(dá)受到遺傳選育的影響，并且可能對雞的體重和長期能量穩(wěn)態(tài)起到重要的調(diào)節(jié)作用。
　　2.蛋雞和肉雞下丘腦CRH、GR基因啟動(dòng)子的甲基化分析及蛋內(nèi)激素水平的比較
　　本試驗(yàn)通過比較蛋雞和肉雞下丘腦CRH、GR基因啟動(dòng)子的甲基化水平以及兩品種雞種蛋內(nèi)的leptin、皮質(zhì)酮的水平，來觀察CRH和GR基因表達(dá)的品種差異是否伴隨DNA甲基化的差異，并觀察蛋內(nèi)激素水平在品種間是否不同。甲基

6、化敏感限制性內(nèi)切酶PCR法的研究發(fā)現(xiàn)，CRH和GR基因啟動(dòng)子片段的甲基化水平在品種間沒有差異(P＞0.05)。放射免疫分析法（RIA）和酶免疫分析法（EIA）的結(jié)果顯示肉雞蛋黃中l(wèi)eptin以及皮質(zhì)酮的水平均顯著高于蛋雞(P＜0.05)。以上結(jié)果提示:蛋中的母源性激素如leptin、皮質(zhì)酮在品種間存在差異，但這種差異是否與生長和基因表達(dá)的品種差異有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。
　　3蛋內(nèi)注射leptin對雛雞下丘腦食欲和能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)相關(guān)基

7、因表達(dá)的影響
　　為了探討母源性leptin對三黃肉雞育雛期下丘腦食欲和能量穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因表達(dá)的影響，本試驗(yàn)挑選蛋重相近的三黃肉雞種蛋，隨機(jī)分為三組:蛋清內(nèi)注射100μL溶劑(PBS)的對照組（control，Con），leptin處理組分別注射0.5μg/100μL PBS（低劑量組，LL）和5.0μg/100μL PBS（高劑量組，HL）的重組小鼠leptin，出雛后飼養(yǎng)至21日齡時(shí)采取樣品。蛋內(nèi)注射leptin影響肉雞出雛后的

8、早期生長，并呈現(xiàn)性別特異性和劑量依賴性。注射高、低劑量的leptin均使得肉雞出雛重下降，特別是低劑量組母雞(P＜0.01)。育雛期處理組肉雞的生長速度高于對照組，21日齡時(shí)處理組肉雞的體重顯著高于對照組(P=0.042，P=0.003)。Real-time RT-PCR和Western blotting方法檢測發(fā)現(xiàn)，leptin注射影響21日齡肉雞下丘腦基因和蛋白的表達(dá)，高劑量組公雞表現(xiàn)更為明顯。除了CRH mRNA表達(dá)沒有變化外，高

9、劑量組公雞下丘腦中LEPR、FAS、GR的mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)(P＜0.05)。Leptin處理組公雞下丘腦中FTO mRNA的表達(dá)均極顯著地升高(P＜0.01)。母雞只有低劑量組GR mRNA的表達(dá)顯著下降(P＜0.05)。公雞下丘腦中CRH蛋白含量在高劑量組顯著升高（P＜0.05），GR蛋白水平在高、低劑量組均極顯著升高(P＜0.01)，而母雞無顯著變化(P＞0.05)。原位雜交的結(jié)果顯示，GR mRNA廣泛分布于21日齡肉雞腦的

10、各個(gè)區(qū)域，主要是大腦紋狀體、丘腦的圓核(ROT)、背外側(cè)核(DLN)、卵圓核(OV)、上網(wǎng)狀核(Rsd)等，在下丘腦視前區(qū)(POA)也有較多分布，其次是下丘腦外側(cè)區(qū)(LHy)、室旁核（PVN）、室周核(PHN)、腹內(nèi)側(cè)核(VMN).漏斗核（IN）和海馬(Hp)等。其中高、低劑量leptin均使得PVN、PHN和VMN中GR mRNA的表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，而對LHy、IN和Hp的GR mRNA影響不顯著(P＞0.05)。以上結(jié)果提示

11、:蛋內(nèi)注射leptin影響肉雞育雛期的生長發(fā)育，改變下丘腦食欲和能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，特別是GR的水平。
　　4蛋內(nèi)注射leptin及其拮抗劑對雛雞下丘腦食欲和能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　為了進(jìn)一步探討母源性leptin對三黃肉雞育雛期下丘腦食欲和能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的影響機(jī)制，本試驗(yàn)挑選蛋重相近的三黃肉雞種蛋，隨機(jī)分為四組:對照組(100μL PBS，Con)、leptin處理組(0.5μg，L)、lep

12、tin拮抗劑組(0.5μg，LA)和leptin+leptin拮抗劑組（各0.5μg，L+LA）。出雛后飼養(yǎng)至21日齡時(shí)進(jìn)行采樣。蛋內(nèi)注射leptin及其拮抗劑影響肉雞出雛后的早期生長和下丘腦中相關(guān)因子的水平，并呈現(xiàn)性別差異。蛋內(nèi)注射leptin及其拮抗劑后，肉雞的出雛重和Con組相比無明顯差異(P＞0.05)。無論公母，和其它三組相比，蛋內(nèi)注射leptin顯著提高了肉雞育雛期的體重、相對體增重(P＜0.05)，也提高了育雛期肉雞的采食

13、量，和Con組相比差異顯著(P＜0.05);兩個(gè)拮抗劑組和Con組相比，體重、采食量等差異不明顯(P＞0.05)。RIA的結(jié)果顯示，21日齡時(shí)LA、L+LA組母雞血清中l(wèi)eptin的水平顯著高于Con組和L組(P＜0.05)。Real-time RT-PCR和Western blotting方法檢測發(fā)現(xiàn)，21日齡時(shí)L組母雞的GR mRNA表達(dá)顯著低于Con組(P＜0.05)。L+LA組公雞LEPR mRNA顯著高于Con組(P＜0.05

14、)，而CRH mRNA水平反而低（P＜0.05）。蛋白水平只有L組公雞的GR升高，顯著高于Con組(P＜0.01)和L+LA組(P＜0.05)。熒光原位雜交(FISH)的結(jié)果顯示，和Con組相比，母雞21日齡時(shí)L組PVN、PHN中GR mRNA的表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，L+LA組的GR mRNA在PHN（P＜0.01）和LHy（P＜0.05）表達(dá)下調(diào)。以上結(jié)果基本上重復(fù)了leptin蛋注的試驗(yàn)，并證明了蛋內(nèi)注射leptin可程序化的影