端粒酶抑制劑作用人肝癌、鼻咽癌細(xì)胞株前后基因表達(dá)譜和蛋白表達(dá)譜變化的研究.pdf

1、目的：通過(guò)分析不同作用機(jī)制端粒酶抑制劑分別作用肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、鼻咽癌細(xì)胞株CNE2后基因表達(dá)譜和蛋白表達(dá)譜的變化情況，挖掘不同端粒酶抑制劑影響的共性變化基因和共同差異蛋白，探討影響端粒酶活性的可能分子靶點(diǎn)。 方法：1、MTT試驗(yàn)檢測(cè)三種不同機(jī)制端粒酶抑制劑：EGCG，針對(duì)hTR的反義核苷酸序列ASODN和針對(duì)hTR的正義核苷酸序列SODN，分別抑制肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的最佳作用濃度。2

2、、培養(yǎng)兩種癌細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以EGCG，ASODN和SODN的最佳作用濃度作用于細(xì)胞，提取藥物作用后細(xì)胞的RNA，運(yùn)用Affymetrix U133A 2.0人基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)基因表達(dá)譜的變化，篩選共同差異基因。3、用EGCG，ASODN，SODN，ADM，ATRA，AZT，HAODN，HSODN八種不同的端粒酶抑制劑分別作用于SMMC-772l和CNE2細(xì)胞，提取藥物作用后細(xì)胞的總蛋白，運(yùn)用基層輔助激光解析時(shí)間飛行質(zhì)譜(SELI

3、D-TOF-MS)技術(shù)檢測(cè)蛋白的變化，篩選共同差異蛋白。 結(jié)果：1、MTT試驗(yàn)結(jié)果：以細(xì)胞抑制率達(dá)50％左右的藥物濃度為最佳作用濃度，作用48h后，EGCG，ASODN及SODN對(duì)SMMC-772l細(xì)胞的最佳作用濃度分別為：125.0 mg/L，6.0 μ mol/L，6.0 μ mol/L；對(duì)CNE2細(xì)胞的最佳作用濃度同樣為：125.0 mg/L，6.0 μ mol/L，6.0 μ mol/L。 2、EGCG，ASOD

4、N及SODN三種端粒酶抑制劑作用兩種癌細(xì)胞后基因表達(dá)譜變化程度不一： (1)肝癌SMMC-7721細(xì)胞中，經(jīng)EGCG作用后，表達(dá)差異2倍以上的基因共196個(gè)，包括上調(diào)基因132個(gè)和下調(diào)基因64個(gè)；ASODN作用后表達(dá)差異基因2025個(gè)，包括上調(diào)基因897個(gè)，下調(diào)基因1128個(gè)；經(jīng)SODN作用后表達(dá)差異基因2337個(gè)，包括上調(diào)基因1254個(gè)，下調(diào)基因1083個(gè)。ASODN和SODN均改變了14500個(gè)基因中近14％基因的表達(dá)，EG

5、CG影響表達(dá)的基因則不足2％。 (2)鼻咽癌CNE2細(xì)胞經(jīng)EGCG作用后，表達(dá)差異2倍以上的基因3193個(gè)，包括上調(diào)基因1217個(gè)，下調(diào)基因1976個(gè)；ASODN作用后表達(dá)差異基因262個(gè)，包括上調(diào)基因158個(gè)和下調(diào)基因104個(gè)；SODN作用后表達(dá)差異基因151個(gè)，包括上調(diào)基因34個(gè)，下調(diào)基因117個(gè)。ASODN和SODN影響表達(dá)的基因均不足2％，EGCG影響表達(dá)的基因則達(dá)22％。 3、EGCG，ASODN及SODN三種

6、端粒酶抑制劑作用兩種癌細(xì)胞后的共同差異基因： (1)EGCG作用SMMC-7721細(xì)胞及CNE2細(xì)胞后均上調(diào)的10個(gè)基因：BTGI，TXNIP，SGK，LDLR，TRIBI，PER2，HISTIH2AG，HIFO，TFPI，HSPBAPI；均下調(diào)的8個(gè)基因：IDI，ID2，ID3，F(xiàn)ABP3，AKRIBl0，PTGES，HSPHI，ANGPTL4。 (2)ASODN作用SMMC-7721細(xì)胞及CNE2細(xì)胞后均上調(diào)的11個(gè)基因：T

7、IMP3，CYP51AI，NT5E，SPRY2，F(xiàn)GF2，AREG，SC4MOL，DDIT3，ETV4，RASA4，PHLDAI；均下調(diào)的9個(gè)基因：DCN，AKRIBIO，MRl，MUCl，UGTIAl0，AKRIC3，LXN，TMEM45A，UGTIA8。 (3)SODN作用SMMC-7721細(xì)胞及CNE2細(xì)胞后，均上調(diào)的2個(gè)基因：SERPINEI，KRTHA4；均下調(diào)的7個(gè)基因：KIAA0152，ANP32A，NPTXI，A

8、PISl，HMGCSI，HISTIH4C，SC4MOL。 (4)三種抑制劑作用SMMC-7721細(xì)胞后，均上調(diào)的12個(gè)基因：BTGI，WSBI，MXII，CCNG2，BCL6，WASL，SCAMPl，HIFO，RALGDS，F(xiàn)OS，TFPI，KLHL24：均下調(diào)的4個(gè)基因：D1O2，AKRIB10，ID3，AKRIC1。 (5)三種抑制劑作用CNE2細(xì)胞后，均上調(diào)僅1個(gè)基因KRTHA4，均下調(diào)僅1個(gè)基因CA5B。

9、 (6)共同表達(dá)差異基因的功能涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞凋亡、能量代謝等。 4、ADM，ATRA，AZT，ASODN，SODN，EGCG，HASODN和HNODN八種端粒酶抑制劑作用兩種癌細(xì)胞后蛋白表達(dá)譜的變化： (1)SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)八種端粒酶抑制劑作用后，分別有28，20，33，12，24，18，10，23個(gè)蛋白質(zhì)低表達(dá)；分別有6，20，7，41，13，25，42，20個(gè)蛋白質(zhì)高表達(dá)。

10、 (2)CNE2細(xì)胞經(jīng)八種端粒酶抑制劑作用后，分別有14，26，27，23，31，42，26，30個(gè)蛋白低表達(dá)；分別有22，11，18，18，7，7，13，8個(gè)蛋白質(zhì)高表達(dá)。 5、ADM，ATRA，AZT，ASODN，SODN，EGCG，HASODN和HNODN八種端粒酶抑制劑作用兩種癌細(xì)胞后的共同差異蛋白： (1)于SMMC-7721細(xì)胞，八種端粒酶抑制劑作用組均呈低表達(dá)的差異蛋白6個(gè)，相對(duì)分子量分別為2477.89

11、Da，3723.96 Da，3898.37 Da，4067.51Da，4127.75 Da和4216.32 Da；均高表達(dá)的差異蛋白2個(gè)，相對(duì)分子量分別為2205.47Da和6647.26 Da。 (2)于CNE2細(xì)胞，八個(gè)端粒酶抑制劑作用后均呈低表達(dá)的差異蛋白1個(gè)，相對(duì)分子量為2657.14 Da；無(wú)共同高表達(dá)的差異蛋白。 結(jié)論： 1、在同種腫瘤細(xì)胞中，三種端粒酶抑制劑EGCG、ASODN及SODN作用后，表現(xiàn)

12、出共性變化的基因。ADM，ATRA，AZT，ASODN，SODN，EGCG，HASODN和HNODN八種端粒酶抑制劑作用后，亦表現(xiàn)出共性變化的蛋白。這些基因與蛋白可能參與了端粒酶活性的調(diào)控，并可能為調(diào)控端粒酶活性的關(guān)鍵點(diǎn)和不同機(jī)制端粒酶抑制劑作用的共同靶點(diǎn)。 2、在不同腫瘤細(xì)胞(SMMC-7721細(xì)胞和CNE2細(xì)胞)之間，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)三種端粒酶抑制劑作用后均共性變化的基因；也無(wú)八種端粒酶抑制劑作用后均共性變化的蛋白。提示端粒酶抑制劑