差異表達的ANXA10對人原發(fā)性肝癌細胞株(HepG2)基因表達譜影響的研究.pdf

1、目的:
　　1、構(gòu)建人ANXA10過表達慢病毒并轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株HepG2。
　　2、檢測ANXA10過表達慢病毒對人肝癌細胞株HepG2基因表達譜的影響，初步闡明ANXA10在原發(fā)性肝癌發(fā)生和發(fā)展中的基因調(diào)控作用，為原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵基因及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究打下基礎(chǔ)，為肝癌基因治療尋找新的途徑和理想的靶點。
　　方法:
　　1、體外實驗，構(gòu)建攜帶GFP過表達慢病毒ANXA10，并將過表達慢病毒ANXA1

2、0以MOI=10轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株HepG2，分成實驗組（LV-ANXA10組）和空白對照組。過表達慢病毒ANXA10的轉(zhuǎn)染效率的確定是采用在熒光顯微鏡觀察GFP表達，采用Illumina-Solexa測序比較兩組細胞基因表達譜的差異，并采用qPCR驗證相關(guān)的部分差異基因。
　　2、體內(nèi)實驗，用胰酶消化處于對數(shù)期生長的HepG2細胞，制成單細胞懸液，取200ulHepG2細胞懸液（1×107個/ml）接種于裸鼠右側(cè)腋下。于接種后1周

3、左右開始成瘤，第24天時瘤體直徑約1-2cm大小，采用拖頸方式處死裸鼠并取出瘤體，剪成1mm3大小，分別接種至16只雌性裸鼠（6-8周齡）右側(cè)腋窩皮下，1周后瘤體直徑約0.3-0.5cm大小，將裸鼠隨機分為2組，命名為實驗組（轉(zhuǎn)染過表達慢病毒ANXA10）、空白對照組(PBS組)。實驗組每只裸鼠給予過表達慢病毒ANXA10量為2×107TU(100ul)，空白對照組每只裸鼠給予100ul濃度為0.01mol/L的PBS;3h后再次注射一

4、次。4周以后采用拖頸方式處死16只裸鼠，并取出裸鼠皮下瘤體。采用免疫組化檢測部分差異基因的表達水平。
　　結(jié)果:
　　1、重組慢病毒ANXA10對人肝癌細胞株HepG2的數(shù)字基因表達譜有影響，通過對生物信息的分析，實驗組與空白對照組比較，共有118個基因表達上調(diào)，12個基因表達下調(diào)。
　　2、熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示，實驗組與空白對照組比較，實驗組中VEGF、NDRG1、ATG4bmRNA表達明顯下調(diào)，而HIF-

5、1αmRNA表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與DGE的分析結(jié)果一致。
　　3、免疫組化檢測裸鼠皮下移植瘤結(jié)果顯示:實驗組較空白對照組的VEGF、NDRG1、ATG4b蛋白質(zhì)表達明顯下調(diào);而HIF-1α蛋白質(zhì)表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與qPCR分析結(jié)果一致，進一步證實HIF-1α、VEGF、NDRG1、ATG4b在轉(zhuǎn)染過表達慢病毒ANXA10的HepG2細胞和HepG2細胞的差異表達。
　　結(jié)