鼻咽癌細胞中14-3-3σ相關miRNAs差異表達譜研究.pdf

1、[目的]通過miRNA芯片技術獲得14-3-3σ（SFN）所調控的miRNAs差異表達譜；通過RT-PCR技術驗證芯片結果的可靠性；生物信息學分析獲得的miRNAs差異表達譜所涉及的信號通路；闡明 miRNA-SFN之間的調控機制在鼻咽癌中的作用。
　　[方法]構建14-3-3σ高表達的重組細胞系5-8F-14-3-3σ(+)以及對照組細胞系5-8F-14-3-3σ(-)。經(jīng)過Western blot檢測兩組細胞中14-3-3σ蛋

2、白表達水平，確定轉染成功。收集細胞，提取RNA，檢測總RNA純度，通過miRNA芯片檢測SFN所調控的miRNAs差異表達譜。miRanda軟件分析了下調倍數(shù)最大的10個靶 miRNAs的熱動力學穩(wěn)定性分值（mirSVR）和序列保守性分值（PhastCons），確定SFN的靶miRNAs。通過miRwalk在線軟件進行預測和分析SFN的靶miRNAs。結合基因芯片結果進行對比分析，找出SFN的靶miRNA。TargetScan在線軟件預

3、測靶miRNA和SFN的結合位點。對SFN的靶miRNA進行qRT-PCR驗證，與芯片結果進行比較。生物信息學分析14-3-3σ相關 miRNAs表達譜涉及到的信號通路、生物學過程、分子功能及細胞組分，從中找出關鍵的信號通路。
　　[結果]1.Western blot檢測5-8F-14-3-3σ(+)細胞中14-3-3σ蛋白的表達水平明顯高于5-8F-14-3-3σ(-)和5-8F細胞，而5-8F-14-3-3σ(-)和5-8F兩

4、組間蛋白表達無明顯差異。2. miRNA芯片檢測5-8F-14-3-3σ(+)和5-8F-14-3-3σ(-)兩個細胞系之間的差異miRNAs，獲得14-3-3σ調控的miRNAs差異表達譜。miRNA芯片顯示SFN高表達后有239個miRNAs差異表達，其中上調的miRNAs有58個，而下調的miRNAs有181個。3.10個下調差異倍數(shù)最大的miRNAs中，通過miRanda軟件分析發(fā)現(xiàn)符合條件的miRNAs（mirSVR≤-0.1

5、，PhastCons0.4~0.7）有2個。因此，miR-675，miR-4253可能是SFN的靶miRNA。4. SFN的靶miRNAs通過miRwalk在線軟件進行預測和分析，結果發(fā)現(xiàn)：10個軟件當中有6個軟件同時預測到了miR-145和miR-220c可與SFN結合；有5個軟件同時預測到了miR-597，miR-129-3p，miR-603，miR-769-3p，miR-431，miR-608，miR-766，miR-31，miR

6、-532-3p，miR-675，miR-922，miR-329，miR-483-3p，miR-554，miR-642，miR-886-5p，miR-362-3p，miR-486-3p等18個miRNAs可與SFN結合。與基因芯片結果對比分析，發(fā)現(xiàn)，miR-675可能是SFN作用的靶miRNA。5. Targetscan軟件預測miR-675與SFN結合的位點，發(fā)現(xiàn)該結合位點位于SFN基因226-232堿基，其結合的序列是5'-CCGCA

7、CC-3'與miR-675部分序列一致。miRNA通過結合到SFN基因的3`-UTR,調控SFN的表達，兩者的結合具有特異性，進一步說明SFN可能是miR-675的可靠的作用靶基因。6.生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，差異miRNAs調控的靶基因當中，涉及到的信號通路主要包括WNT、MAPK、TGF-β。7.RT-PCR驗證 miR-675和miR-4253的表達水平，miR-675和miR-4253在5-8F-14-3-3σ(+)中表達量分別為對

8、照組5-8F-14-3-3σ(-)的-3.458和-5.098倍，與基因芯片結果一致。表明基因芯片結果檢測可靠。
　　[結論]1.獲得了14-3-3σ調控的miRNAs表達譜，在鼻咽癌細胞中14-3-3σ表達增高后，上調的miRNAs有58個，下調的miRNAs有181個；2.生物信息學分析結果表明，14-3-3σ相關miRNAs表達譜涉及到的功能復雜，其中WNT、MAPK、TGF-β信號通路可能與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展有關；3. miR