鼻咽癌放療抵抗相關(guān)microRNA差異表達(dá)譜的建立.pdf

1、背景:
　　 鼻咽癌系我國南部及東南亞地區(qū)常見頭頸部惡性腫瘤之一，放射治療為其首選治療手段，但放療抗拒的存在限制了其療效。腫瘤放療抗拒的產(chǎn)生是一個(gè)多基因、多因子和多機(jī)制共同作用的復(fù)雜過程，細(xì)胞內(nèi)或者放療過程中細(xì)胞出現(xiàn)對(duì)放射線抗拒的細(xì)胞成分是腫瘤放療抵抗產(chǎn)生的重要原因。已有的研究顯示DNA修復(fù)基因蛋白表達(dá)量增高、細(xì)胞乏氧效應(yīng)、放療后促血管生成效應(yīng)以及自噬性調(diào)節(jié)是腫瘤細(xì)胞對(duì)抗放射線的主要途徑。但放療抗拒的具體分子機(jī)制目前仍不清楚。<

2、br>　　 microRNA（miRNA）是一種內(nèi)源性非編碼RNA，通過結(jié)合到靶基因mRNA3’非翻譯區(qū)(3'UTR)抑制其翻譯等機(jī)制，調(diào)控靶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而影響靶蛋白質(zhì)的表達(dá)。miRNA參與到腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等多種惡性生物學(xué)行為的調(diào)控中。已有研究證實(shí)miRNA參與腫瘤放療敏感性的調(diào)控。對(duì)放療抵抗細(xì)胞或組織表達(dá)改變的miRNA的篩選，將對(duì)鼻咽癌放療抵抗性的逆轉(zhuǎn)、放療效果的提高提供新的啟示和依據(jù)。
　　 目的

3、:
　　 (1)利用X線梯度照射法建立人鼻咽癌放射抗拒細(xì)胞(CNE-2-Rs)，為研究放射抗拒機(jī)理提供可比性的成對(duì)細(xì)胞株。
　　 (2) Illumina Hiseq2000測(cè)序系統(tǒng)檢測(cè)，與已知數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，從兩樣本RNA中篩選出差異表達(dá)miRNA，構(gòu)建放療抵抗microRNA表達(dá)譜。通過生物信息學(xué)分析差異表達(dá)miRNA與及其靶基因，研究可能的生物學(xué)功能和機(jī)制通路，為放療抵抗相關(guān)基因表達(dá)及其轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)提供更直接的科學(xué)線

4、索。
　　 方法:
　　 (1)建立鼻咽癌放療抵抗細(xì)胞株:應(yīng)用X射線梯度照射的鼻咽癌CNE-2細(xì)胞系篩選出放療抵抗細(xì)胞株CNE-2-Rs; CCK-8法檢測(cè)放射后細(xì)胞生存率差異;應(yīng)用細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的放療敏感性;細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞放射后增殖能力差異。
　　 (2)鼻咽癌放療抵抗相關(guān)miRNA差異表達(dá)譜的建立:將建立的放療抵抗細(xì)胞株與其親代細(xì)胞株提取RNA，通過Illumina Hiseq2000測(cè)序系統(tǒng)

5、檢測(cè)，與已知數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，從兩樣本RNA中篩選出差異表達(dá)miRNA。將差異表達(dá)的miRNA分為上調(diào)組和下調(diào)組，分別利用Target-Scan5.1與PicTar2種計(jì)算方法對(duì)選定的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，交集的基因集合分別進(jìn)行GO富集分析和KEGG分析，預(yù)測(cè)可能的靶基因和信號(hào)通路。
　　 結(jié)果:
　　 (1)X線梯度照射可誘導(dǎo)建立鼻咽癌抵抗細(xì)胞:①不同放療劑量下，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞株CNE-2-Rs的生存率高于CN

6、E-2;②CNE-2-Rs放療后的增殖能力高于CNE-2，放療抑制率低于CNE-2;③細(xì)胞株CNE-2-Rs集落形成能力強(qiáng)于CNE-2細(xì)胞，多靶單擊模型和線性二次模型擬合細(xì)胞存活曲線，相關(guān)指標(biāo)均提示CNE-2-Rs較CNE-2具有放療抵抗性，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。
　　 (2)建立鼻咽癌放療抵抗相關(guān)miRNA差異表達(dá)譜。①篩選出具有差異表達(dá)已知miRNA192個(gè)（上調(diào)107個(gè)，下調(diào)85個(gè)，p＜0.05），其中具有顯著

7、差異的miRNA50個(gè)(Fold-change＞1.00或Fold-change＜-1.00，p＜0.05;上調(diào)36個(gè)，下調(diào)14個(gè))。②21個(gè)miRNA簇(cluster)和miRNA家族(family)都存2個(gè)以上miRNA表達(dá)的差異。
　　 信息分析結(jié)果:①GO分析提示:下調(diào)的14個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因?yàn)楦患凇吧锔呔畚镄揎?biopolymer modification)”、“蛋白修飾過程(protein modifi

8、cation process)”等28個(gè)生物過程(p＜0.05)。上調(diào)的36個(gè)miRNA未發(fā)現(xiàn)明顯富集的生物過程。②KEGG分析提示:下調(diào)的14個(gè)miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因富集于4條通路“腫瘤相關(guān)通路(Pathways in cancer)”、“嘌呤代謝途徑(Purine metabolism)”、“Wnt信號(hào)通路(Wnt signaling pathway)”和“軸突導(dǎo)向通路(Axonguidance)”信號(hào)通路(q＜0.05);上調(diào)的m

9、iRNA未有明顯的富集通路。
　　 結(jié)論:
　　 (1)本實(shí)驗(yàn)通過梯度照射模式證實(shí)其可以增加細(xì)胞的放療抵抗性。結(jié)果提示，在體外條件下這種篩選模式也可能篩選或誘導(dǎo)出放射抗拒的細(xì)胞，為放療篩選放療抵抗細(xì)胞株提供了一個(gè)新的放療篩選方案。
　　 (2)鼻咽癌放療抵抗相關(guān)miRNA差異表達(dá)譜的建立，綜合信息學(xué)分析提供了數(shù)個(gè)可能的富集生物過程和富集通路，如Wnt通路和相關(guān)microRNA，為我們后續(xù)的研究提供了研究的方向和依