NALP3炎癥復(fù)合體在腦缺血再灌小鼠腦組織中的動態(tài)表達(dá)及大黃酚的神經(jīng)保護作用.pdf

1、目的:腦血管病是導(dǎo)致我國成人殘疾和死亡的第一原因，其中以缺血性腦血管病最為常見。治療腦缺血最有效的辦法是再灌，但再灌本身又會導(dǎo)致組織損傷，其中炎癥扮演了主要角色。NALP3炎癥復(fù)合體是一種多蛋白復(fù)合結(jié)構(gòu)。它由NALP3(NACHT domain-，leucine-rich repeat-，andpyrin domain(PYD)-containing protein3)、ASC(apoptosis-associatedspeck-lik

2、e protein containing a caspase recruitment domain)和caspase-1組成，其功能主要為調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答。
　　大黃酚是大黃屬植物的提取物，擁有多種藥理作用，其中包含抗炎特性，但其抗炎機制仍有待闡明。本實驗就大黃酚對腦缺血再灌的作用，及其潛在機制進行研究。利用雄性CD1小鼠暫時性大腦中動脈閉塞(transientmiddle cerebral artery occlusion，tMCA

3、O)所致腦缺血再灌的模型，觀察腦缺血再灌后大腦皮層NALP3炎癥復(fù)合體的動態(tài)表達(dá)，并研究大黃酚在腦缺血再灌急性期的神經(jīng)保護作用及其對NALP3炎癥復(fù)合體表達(dá)的影響。
　　方法:雄性CD1小鼠(25-30 g)，應(yīng)用改良Longa線栓法建立大鼠右側(cè)tMCAO模型。實驗分為兩部分。
　　實驗一，動態(tài)觀察腦缺血再灌后不同時間點NALP3炎癥復(fù)合體的表達(dá)。實驗動物隨機分為Sham組（Sham+生理鹽水）、缺血再灌后3h、6h、12h

4、、24 h、48 h、72 h六個時間點組(tMCAO+生理鹽水)。
　　實驗二，探索大黃酚在腦缺血再灌早期的神經(jīng)保護作用。實驗動物隨機分為Sham組（Sham+生理鹽水）、tMCAO組（tMCAO+生理鹽水）、Vehicle組(tMCAO+1％ DMSO+1％ Tween-80)、大黃酚大劑量組(tMCAO+chrysophnol10 mg/kg，CHR-H)、大黃酚中劑量組(tMCAO+chysophnol1 mg/kg，CH

5、R-M)、大黃酚小劑量組(tMCAO+chysophnol0.1mg/kg，CHR-L)。
　　藥物干預(yù)組動物于梗死前30分鐘腹腔注射大黃酚。Sham組和tMCAO組用同樣方法給予等量生理鹽水，Vehicle組給予等量溶劑(1％DMSO+1％ Tween-80)。術(shù)后24 h對小鼠進行神經(jīng)功能評分。評分完畢后將動物斷頭處死，用干濕重法測定腦組織含水量，用2％的2，3，5-三苯基四唑氮紅(triphenyltetrazolium c

6、hloride，TTC)染色法測定腦梗死體積，用伊文斯蘭染色法測定血腦屏障通透性，用免疫組化、western blotting、 qRT-PCR和激光共聚焦技術(shù)測定NALP3炎癥復(fù)合體和IL-1β的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.NALP3，ASC，caspase-1及IL-1β存在于神經(jīng)元中用激光共聚焦顯微鏡對NALP3炎癥復(fù)合體及IL-1β在腦皮質(zhì)的表達(dá)進行細(xì)胞定位。在tMCAO組中，可在缺血半暗帶明顯觀察到神經(jīng)元核固縮

7、、染色質(zhì)邊集及少量的中性粒細(xì)胞。在正常腦組織（Sham組）中，caspase-1及NALP3主要表達(dá)于細(xì)胞核，IL-1β主要表達(dá)于胞漿。ASC在胞核胞漿中均有表達(dá);缺血再灌后，NALP3及caspase-1的表達(dá)位置發(fā)生變化，主要表達(dá)于胞漿，而ASC與IL-1β的表達(dá)位置不變(Fig.3)。
　　2.NALP3，ASC，caspase-1及IL-1β在腦缺血再灌后表達(dá)上調(diào)用免疫組化，qRT-PCR及western blotting

8、檢測NALP3，ASC，caspase-1及IL-1β的表達(dá)水平。結(jié)果顯示NALP3、active caspase-1在腦缺血再灌后12h表達(dá)水平開始升高，并于24 h達(dá)到高峰(Fig4a，4b，4d，4e，4f)。active IL-1β在腦缺血再灌后6小時表達(dá)水平開始升高，同樣于24 h達(dá)到高峰。ASC表達(dá)水平直至腦缺血再灌后72 h表達(dá)水平才開始升高(Fig4c，4d，4e，4f)。因此，我們選取tMCAO術(shù)后24 h來觀察大黃酚

9、的干預(yù)作用，以期證實大黃酚對急性腦缺血再灌的保護作用。
　　3.大黃酚降低行為學(xué)評分tMCAO術(shù)后24 h，采用6分法對小鼠進行行為學(xué)評分(Fig.5a)。Sham組評分為0。tMCAO組、Vehicle組、藥物干預(yù)組均出現(xiàn)不同程度的左側(cè)肢體偏癱。CHR-H組和CHR-M組的神經(jīng)功能評分明顯低于tMCAO組及Vehicle組(P＜0.05)。CHR-L組與tMCAO組及Vehicle組相比，神經(jīng)功能評分無明顯差異(P＞0.05)。

10、
　　4.大黃酚降低腦梗死體積Sham組無梗死灶。與tMCAO組及Vehicle組相比，CHR-H組及CHR-M組梗死體積明顯減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（CHR-H組vs.tMCAO組和Vehicle組:29.80％±1.15％ vs.49.87％±1.99％和51.31％±1.57％，P＜0.05; CHR-M組vs.tMCAO組和Vehicle組:41.86％±0.98％vs.49.87％±1.99％和51.31％±1.57％，P

11、＜0.05）。CHR-L組與tMCAO組及Vehicle組相比，梗死體積無明顯減小(P＞0.05)(Fig.5b，5c)。
　　5.大黃酚降低腦水腫正常腦組織含水量未見明顯變化。tMCAO術(shù)后24 h，tMCAO組與Vehicle組病變側(cè)腦組織含水量明顯增加。CHR-H組及CHR-M組病變側(cè)腦組織含水量較tMCAO組及Vehicle組顯著減少（CHR-H組vs.tMCAO組和Vehicle組:80.60％±0.58％ vs.83.

12、75％±0.48％和83.72％±0.35％，P＜0.05; CHR-M組vs.tMCAO組和Vehicle組:82.15％±0.68％vs.83.75％±0.48％和83.72％±0.35％,P＜0.05)。 CHR-L組與tMCAO組及Vehicle組相比，病變側(cè)腦組織含水量未見明顯減輕(P＞0.05)(Fig.5d)。
　　6.血腦屏障通透性改善tMCAO術(shù)后24 h，CHR-H組及CHR-M組病變側(cè)腦組織伊文斯蘭含量均明顯

13、低于tMCAO組及Vehicle組(P＜0.05)。CHR-L組與tMCAO組及Vehicle組相比，伊文斯蘭含量未見明顯減少(P＞0.05)(Fig.5e，5f)。
　　7.大黃酚抑制NALP3，ASC，caspase-1及IL-1β的表達(dá)tMCAO術(shù)后24 h，NALP3，ASC，caspase-1及IL-1β免疫組化結(jié)果顯示(Fig.6):NALP3，caspase-1及IL-1β在正常腦皮質(zhì)（Sham組）中表達(dá)量很少。與S

14、ham組相比，tMCAO組NALP3，caspase-1及IL-1β陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P＜0.05)。在Vehicle組中觀察到同樣的結(jié)果，且與tMCAO組無明顯差異(P＞0.05)。在CHR-H組及CHR-M組中，NALP3，caspase-1及IL-1β陽性細(xì)胞個數(shù)較tMCAO組及Vehicle組明顯減少(P＜0.05)(Fig.7e)。之后我們利用western blotting檢測NALP3，ASC(Fig.7a)，caspa

15、se-1(Fig.7b)及IL-1β(Fig.7c)蛋白的表達(dá)水平。與Sham組相比，tMCAO組及Vehicle組NALP3，caspase-1及IL-1β的表達(dá)顯著上升。大、中劑量的大黃酚干預(yù)可明顯降低NALP3，caspase-1及IL-1β的表達(dá)量(P＜0.05)(Fig.7d)。與免疫組化、western blotting結(jié)果一致，tMCAO組及Vehicle組NALP3，caspase-1及IL-1βmRNA的表達(dá)較Sham

16、組明顯增加(P＜0.05)。與tMCAO組及Vehicle組相比，CHR-H組及CHR-M組NALP3，caspase-1及IL-1β的表達(dá)量明顯減少(P＞0.05)(Fig.7f)。
　　結(jié)論:腦缺血再灌后腦組織中NALP3炎癥復(fù)合體及IL-1β的表達(dá)水平顯著升高。大黃酚可以降低行為學(xué)評分，減少腦梗死體積，減輕腦水腫，改善血腦屏障通透性，對局灶性腦缺血具有神經(jīng)保護作用。其保護作用可能與抑制NALP3炎癥復(fù)合體的表達(dá)，下調(diào)IL-1