間質細胞源性因子-1受體拮抗劑AMD3100對顳葉癲癇異常神經(jīng)發(fā)生的調控作用.pdf

1、癲癇是最常見而嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，已被世界衛(wèi)生組織列入全球重點防治的五大神經(jīng)精神疾病。流行病學調查顯示，在我國癲癇患病率高達7‰，我國現(xiàn)有900萬以上癲癇患者，而且還以每年新發(fā)40萬-60萬例的速度遞增。經(jīng)正規(guī)抗癲癇藥物治療，大多數(shù)病人的癲癇發(fā)作可得到控制，但仍有20-30％的病人癲癇難以控制，最終發(fā)展為難治性癲癇，其中60％-70％為顳葉癲癇。顳葉癲癇以自發(fā)的反復癇性發(fā)作，認知障礙和抑郁為其特征，是最常見的難治性癲癇類型。海馬異常

2、的神經(jīng)發(fā)生是顳葉癲癇模型的一個顯著特征，包括苔蘚纖維芽生，顆粒細胞門區(qū)異位遷移，門區(qū)基底樹突，突觸重組等，這些病理變化被認為對大腦異?；顒悠鸬酱龠M作用。在顳葉癲癇的急性期齒狀回的神經(jīng)發(fā)生增強，而在慢性期神經(jīng)發(fā)生則明顯地減低。這可能與新生細胞在急性期和慢性期所處的微環(huán)境的改變有關。間質細胞源性因子-1(Stromal cell-derived Factor1，SDF-1)是骨髓基質細胞產生的CXC類趨化蛋白，在生理狀態(tài)下SDF-1與其特異

3、性受體CXCR4高度表達在側腦室下區(qū)及齒狀回顆粒細胞層下區(qū)這兩個腦內主要的神經(jīng)發(fā)生區(qū)域。近來有研究發(fā)現(xiàn)成年腦內的神經(jīng)干細胞也表達SDF-1/CXCR4。當SDF-1與CXCR4受體結合后，與CXCR4相連的G蛋白被激活，并進一步激活下游的信號傳導途徑，從而使細胞骨架發(fā)生改變，引起神經(jīng)干細胞遷移、黏附，并調節(jié)神經(jīng)干細胞的增殖和分化。在癲癇、中風等形式的腦損傷后，主要由死亡或受損的神經(jīng)細胞、活化的膠質細胞及內皮細胞釋放的SDF-1通過與CX

4、CR4受體結合，能夠吸引神經(jīng)干細胞遷移到細胞變性、死亡區(qū)域及炎癥區(qū)域。如果能夠改變癲癇后新生神經(jīng)細胞所處的微環(huán)境，從而調控異常的神經(jīng)發(fā)生，可能會對癲癇尤其是難治性癲癇的治療起到更積極的作用。我們通過側腦室注射海人酸致顳葉癲癇模型觀察了CXCR4拮抗劑AMD3100對海馬異常神經(jīng)發(fā)生的影響。
　　實驗方法:
　　1、實驗動物的分組:采用雄性Wistar大鼠，體重200-250g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供，隨機分為6組:急

5、性期:(1)假手術組(n=5);(2)癲癇組(n=5);(3) AMD3100組(n=5)。慢性期:(1)假手術組(n=5);(2)癲癇組(n=5);(3) AMD3100組(n=5)。
　　2、顱內注射KA制作顳葉癲癇模型:采用顱內注射海人酸(kainic acid，KA)的方法制作顳葉癲癇模型。根據(jù)大鼠腦解剖圖譜，用立體定位的方法將KA注射到大鼠側腦室制作模型。
　　3、微量滲透泵顱內給藥:在造模后第1天或第61天，用立

6、體定位的方法在頸部皮下埋置灌注AMD3100的微量滲透泵，進行側腦室內持續(xù)給藥，連續(xù)7天。
　　4、5-嗅脫氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine，BrdU)示蹤標記:在造模后第8天或第72天，向腹腔內注射BrdU100mg/kg標記神經(jīng)干細胞，每天2次，間隔12小時，連續(xù)2天，最后一次注射后24小時取材。
　　5、組織切片的制備:以上各組動物分別于造模后第10天或第74天用多聚甲醛灌注固定，取腦，用恒冷切片機行連

7、續(xù)腦冠狀冰凍切片(片厚50μm)。
　　6、免疫熒光染色:用免疫熒光法觀測大鼠海馬齒狀回DCX、BrdU、DCX/BrdU陽性細胞并測定海馬門區(qū)異位遷移的顆粒細胞數(shù)及樹突發(fā)育情況。
　　7、共聚焦顯微鏡成像:在共聚焦顯微鏡下獲取海馬齒狀回區(qū)域DCX陽性細胞的Z軸方向系列圖層后，對新生神經(jīng)細胞樹突及軸突進行三維重建，然后使用NIHImageJ軟件對樹突、軸突及其分支進行追蹤描繪與測量，以觀察DCX陽性細胞的樹突發(fā)育成熟情況。<

8、br>　　8、行為學測試:應用Morris水迷宮實驗對大鼠學習記憶功能進行定量評價。
　　9、腦電圖記錄:在造模后第72天進行腦電圖描計，觀察各組大鼠癇性發(fā)作頻率及平均持續(xù)時間。
　　10、統(tǒng)計學處理:實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差表示。數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計分析軟件SPSS17.0 for windows進行。應用單因素方差分析或重復測量方差分析來判斷差異的統(tǒng)計學意義。
　　實驗結果:
　　1、AMD3100對顳葉癲癇急性期

9、海馬齒狀回神經(jīng)細胞增殖的影響。癲癇組大鼠海馬齒狀回DCX、DCX/BrdU陽性細胞數(shù)目較假手術組明顯地增加(P＜0.01)，AMD3100組大鼠海馬齒狀回DCX、DCX/BrdU陽性細胞數(shù)目較癲癇組明顯減少(P＜0.01)。
　　2、AMD3100對顳葉癲癇慢性期海馬齒狀回神經(jīng)細胞增殖的影響。癲癇組大鼠海馬齒狀回DCX、DCX/BrdU陽性細胞數(shù)目較假手術組減少(P＜0.01)，AMD3100組大鼠海馬齒狀回DCX、DCX/Brd

10、U陽性細胞數(shù)目較癲癇組明顯減少(P＜0.01)。
　　3、AMD3100對顳葉癲癇急性期新生神經(jīng)細胞異位遷移的影響。癲癇組海馬門區(qū)的DCX陽性細胞數(shù)顯著多于假手術組(P＜0.01)，AMD3100組大鼠海馬門區(qū)DCX陽性細胞數(shù)較癲癇組明顯減少(P＜0.01)。
　　4、AMD3100對顳葉癲癇慢性期新生神經(jīng)細胞異位遷移的影響。癲癇組海馬門區(qū)的DCX陽性細胞數(shù)顯著多于假手術組(P＜0.01)，AMD3100組大鼠海馬門區(qū)DCX

11、陽性細胞數(shù)較癲癇組明顯減少(P＜0.01)。
　　5、AMD3100對顳葉癲癇急性期齒狀回顆粒細胞樹突發(fā)育的影響。癲癇組大鼠海馬齒狀回顆粒細胞的項樹突及基底樹突長度顯著長于假手術組(P＜0.01)，AMD3100組大鼠海馬齒狀回顆粒細胞的項樹突及基底樹突長度較癲癇組明顯減少(P＜0.01)。
　　6、AMD3100對顳葉癲癇慢性期齒狀回顆粒細胞樹突發(fā)育的影響。癲癇組大鼠海馬齒狀回顆粒細胞的頂樹突及基底樹突長度顯著長于假手術組

12、(P＜0.01)，AMD3100組大鼠海馬齒狀回顆粒細胞的頂樹突及基底樹突長度較癲癇組明顯減少(P＜0.01)。
　　7、AMD3100對顳葉癲癇慢性期大鼠學習記憶功能的影響與假手術組相比，癲癇組的逃避潛伏期明顯延長(P＜0.01)，而穿越平臺次數(shù)明顯減少(P＜0.01)。AMD3100組與癲癇組相比，逃避潛伏期有所縮短，穿越平臺的次數(shù)增多，但兩組間差異并沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　8、AMD3100對顳葉癲癇慢性

13、期大鼠癇樣放電的影響。癲癇組大鼠腦電圖可以記錄到持續(xù)存在散在發(fā)作的棘波。AMD3100組大鼠腦電圖棘波出現(xiàn)的頻率及每次出現(xiàn)持續(xù)的時間均明顯減少(P＜0.01)。
　　結論:
　　1、AMD3100抑制了顳葉癲癇大鼠急性期與慢性期大鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細胞的增殖。
　　2、AMD3100抑制了顳葉癲癇大鼠急性期與慢性期新生神經(jīng)細胞向海馬門區(qū)的異位遷移。
　　3、AMD3100抑制了顳葉癲癇大鼠急性期和慢性期新生神經(jīng)細