乏氧狀態(tài)下SKOV-,3-人卵巢癌細(xì)胞株HIF-1α及VEGF-A mRNA表達(dá)的變化及化療藥對(duì)其調(diào)節(jié)的研究.pdf

1、腫瘤的生長(zhǎng)具有血管依賴性，腫瘤組織中新生血管的形成不僅為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖提供了氧和養(yǎng)料以及排除代謝產(chǎn)物的途徑，同時(shí)也為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了有利條件。而腫瘤血管生成過(guò)程受到諸多因素的影響，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，能夠特異性地刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管生成，增加血管通透性，在腫瘤血管生成中發(fā)揮中心調(diào)控作用。而VEGF家族中有多個(gè)成員，其中VEGF-A通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性受體Flt-1及Flk-1

2、結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能。乏氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子，它可作用于多種靶基因，使其轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生改變，從而介導(dǎo)組織細(xì)胞產(chǎn)生一系列的缺氧適應(yīng)性反應(yīng)。 目前，研究者們已在多種實(shí)體腫瘤中檢測(cè)到HIF-1α及VEGFmRNA及其蛋白的過(guò)表達(dá)，然而，關(guān)于HIF-1α與VEGF在卵巢癌中的分析國(guó)內(nèi)外均比較分散，而且大部分僅對(duì)HIF-1α或VEGF在卵巢癌中的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。 目的： 本研究旨在

3、通過(guò)檢測(cè)SKOV3人卵巢癌細(xì)胞株在乏氧條件下及化療藥物(紫杉醇)調(diào)節(jié)下HIF-1α及VEGF-A基因mRNA水平表達(dá)的變化及其相互關(guān)系，為探索卵巢癌的早期診斷及其新的治療靶點(diǎn)提供重要的研究依據(jù)。 方法： 1.常規(guī)方法培養(yǎng)SKOV3人卵巢癌細(xì)胞株至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度。 2.分別將2*106細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)入完全培養(yǎng)液至總體積1ml，同時(shí)將化療藥物(紫杉醇)分別以3.4ng/ml(低

4、濃度)、4.5μg/ml(中濃度)、0.45mg/ml(高濃度)三種濃度處理細(xì)胞，并另設(shè)空白對(duì)照組(無(wú)藥物作用)，然后把細(xì)胞分別置于富氧(含21％氧氣)及乏氧(含1％氧氣)兩種環(huán)境中培養(yǎng)。 3.培養(yǎng)不同時(shí)間(30min、1h、4h、8h、24h)后觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化并收取細(xì)胞。 4.提取細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法半定量測(cè)定HIF-1α及VEGF-A基因mRNA在不同培養(yǎng)條件下的表達(dá)水平。

5、 5.分別做出HIF-1α及VEGF-A基因mRNA相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度的柱狀圖以觀察二者之間的關(guān)系，并應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)通過(guò)相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： 1.各種培養(yǎng)條件下SKOV3人卵巢癌細(xì)胞株HIF-1α與VEGF-A基因mRNA的總體表達(dá)陽(yáng)性率均為85％(34/40)。 2.從HIF-1α與VEGF-A基因mRNA表達(dá)強(qiáng)度的柱狀圖可以看出HIF-1α與VEGF-A基因表達(dá)的變化趨勢(shì)

6、大致相同；Spearman等級(jí)相關(guān)法對(duì)二者相關(guān)性的分析結(jié)果同樣表明：HIF-1α與VEGF-A基因密切相關(guān)(Rs=0.9227，P＜0.01)。 3.若不考慮中濃度與高濃度藥物的作用，分析結(jié)果顯示：乏氧環(huán)境下卵巢癌細(xì)胞中HIF-1α及VEGF-A基因的表達(dá)顯著提高(P=0.0059，0.0137)。 4.應(yīng)用兩因素方差分析分別對(duì)紫素濃度對(duì)HIF-1α及VEGF-AmRNA表達(dá)的影響情況進(jìn)行分析，同時(shí)采用SNK法及Tuke

7、yHSD法進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行兩兩比較。結(jié)果顯示：尚不能認(rèn)為不同濃度的紫素可影響HIF-1α及VEGF-AmRNA的表達(dá)(F=1.460，P=0.248，P多重比較=0.273；F=1.239，P=0.315；P多重比較=0.253)。 5.應(yīng)用與4相同的方法對(duì)紫素不同的作用時(shí)間對(duì)HIF-1α及VEGF-AmRNA表達(dá)的影響情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：尚不能認(rèn)為24小時(shí)內(nèi)紫素對(duì)HIF-1α及VEGF-AmRNA的表達(dá)有影響(F=0.894

8、，P=0.480，P多重比較=0.481；F=1.627，P=0.195，P多重比較=0.174)。 6.從細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化中可以看出不同濃度的紫素在短時(shí)間內(nèi)對(duì)SKOV3人卵巢癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)增殖即有不同程度的影響。 結(jié)論： 1.在實(shí)體腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞普遍存在缺氧，而HIF-1α則介導(dǎo)組織細(xì)胞產(chǎn)生一系列的缺氧適應(yīng)性反應(yīng)。 2.VEGF-A是HIF-1α的靶基因，HIF-1α在基因水平上直接調(diào)控VEGF-