氟西汀合并乳腺癌化療藥物臨床應(yīng)用的藥理基礎(chǔ).pdf

1、研究背景:
　　 乳腺癌是全世界婦女最常見的惡性腫瘤之一，在我國，乳腺癌的發(fā)病率也在逐年上升。腫瘤和抑郁相關(guān)性的長期隨訪研究證實(shí)二者共病例比較高。由于乳腺位置的特殊性，使得乳腺癌并發(fā)抑郁障礙的發(fā)生率尤為突出，國內(nèi)外研究顯示乳腺癌病人中抑郁的癥狀呈現(xiàn)率大約在10-30％，抑郁障礙會(huì)嚴(yán)重影響患者的依從性、降低其生活質(zhì)量及預(yù)后、甚至影響化療藥物的藥代動(dòng)力學(xué)從而影響藥物的治療效果。因此臨床對乳腺癌伴發(fā)抑郁癥的患者在化療同時(shí)進(jìn)行抗抑郁治療

2、。氟西汀便是其中之一，臨床研究顯示，接受氟西汀治療的患者其抑郁癥狀明顯得到緩解、生活質(zhì)量明顯提高。
　　 腫瘤化療失敗最主要的一個(gè)原因就是存在多藥耐藥(multidrugresistanceMDR)。多藥耐藥性是指抗某種細(xì)胞毒藥的耐藥細(xì)胞對許多結(jié)構(gòu)上無關(guān)和作用機(jī)制上不同的其他細(xì)胞毒藥物產(chǎn)生交叉耐藥。腫瘤MDR形成涉及以下四大機(jī)制:一、藥物轉(zhuǎn)運(yùn):藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-糖蛋白(P-glycoproteinP-gp)及其編碼基因MDR1基因

3、，P-gp是研究的最多也是MDR形成最主要的蛋白;二、藥物代謝:谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathioneSepoxidetransferaseGST），其中GST同工酶π（GST-π）與腫瘤耐藥及疾病進(jìn)展密切相關(guān);三、細(xì)胞凋亡基因:對那些通過誘導(dǎo)凋亡來殺傷腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤藥物，細(xì)胞凋亡基因的調(diào)控也與MDR發(fā)生息息相關(guān)，這其中就包括正向調(diào)控基因p53和負(fù)向調(diào)控基因Bcl-2;四、藥物靶:拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(topoisomeraseⅡ，topo

4、Ⅱ)，topoⅡ的定量或定性改變均影響藥物療效，這種類型的耐藥稱為不典型MDR。
　　 乳腺癌的多藥耐藥在臨床上也十分常見，逆轉(zhuǎn)乳腺癌化療的多藥耐藥問題是乳腺癌治療中亟待解決的問題。近年來對腫瘤化療MDR逆轉(zhuǎn)劑的研究越來越多，尋找低毒高效的逆轉(zhuǎn)劑是研究的目標(biāo)。以往的三代MDR逆轉(zhuǎn)劑由于不良反應(yīng)嚴(yán)重、溶解性差以及達(dá)到逆轉(zhuǎn)耐藥效果所需劑量大等原因而在臨床應(yīng)用受限。近年來有研究發(fā)現(xiàn)新型抗抑郁藥氟西汀(Fluoxetine，F(xiàn)LX)可逆

5、轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥，有望成為第四代腫瘤化療的增敏劑或MDR逆轉(zhuǎn)劑。
　　 目前，乳腺癌化療方案中合用氟西汀已成為常規(guī)。但這種臨床合并用藥的藥理基礎(chǔ)尚無系統(tǒng)研究。本課題將研究常用的乳腺癌化療藥物阿霉素(AdriamycinADM)、紫杉醇(PaclitaxelPTX)與合用氟西汀后對乳腺癌細(xì)胞的藥理作用及機(jī)制，為臨床乳腺癌化療藥物合并氟西汀的臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)。
　　 本研究擬從兩方面探討氟西汀對乳腺癌細(xì)胞的增敏或逆

6、轉(zhuǎn)耐藥作用。一方面我們從氟西汀誘導(dǎo)凋亡這一設(shè)想出發(fā)，研究聯(lián)合氟西汀前后細(xì)胞凋亡的變化，以及凋亡相關(guān)基因抑癌基因p53、抑凋亡基因Bcl-2的表達(dá)有無差異。另一方面，直接研究多藥耐藥P-gp基因和蛋白的表達(dá)以及GST-π的表達(dá)，探討氟西汀聯(lián)合使用前后P-gp及GST-π的表達(dá)有無改變;從而闡明氟西汀逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥的分子機(jī)制。
　　 研究目的:
　　 1.細(xì)胞水平檢測化療藥物單獨(dú)使用以及合并使用氟西汀對人乳腺癌細(xì)胞敏感株

7、MCF-7及耐藥株細(xì)胞MCF-7/ADM的細(xì)胞毒性作用。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測氟西汀聯(lián)合使用前后對細(xì)胞凋亡的影響。
　　 3.在分子水平對p53、Bcl-2、P-gp、GST-π蛋白以及MDR1mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測，探討氟西汀逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥的分子機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.MTT法檢測氟西汀聯(lián)合用藥前后對細(xì)胞增殖抑制的影響
　　 倍比稀釋氟西汀母液至80、40、20、10、5、2.

8、5μg/ml的工作濃度;同樣的稀釋阿霉素至80、40、20、10、5、2.5μg/ml和4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml;紫杉醇至16、8、4、2、1、0.5μg/ml。進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，加藥72h后檢測細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率小于10％范圍內(nèi)選擇氟西汀的適宜濃度作為聯(lián)合用藥濃度，紫杉醇和阿霉素的用藥濃度不變再次進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。計(jì)算阿霉素、紫杉醇聯(lián)合氟西汀前后的IC50值，得出氟西汀的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。t檢驗(yàn)比較聯(lián)合用藥前

9、后IC50值及阿霉素、紫杉醇單獨(dú)作用MCF-7/ADM和MCF-7兩細(xì)胞IC50值的差異顯著性。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測氟西汀聯(lián)合用藥前后對細(xì)胞凋亡的影響
　　 根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果以IC50值為參考，分別選擇低、高兩濃度作為后續(xù)聯(lián)合用藥的藥物濃度:1,4μg/ml作為紫杉醇聯(lián)合氟西汀作用MCF-7/ADM和MCF-7細(xì)胞的兩個(gè)梯度濃度;5，20μg/ml作為阿霉素作用MCF-7/ADM的聯(lián)合用藥濃度;0.5，2μg/m

10、l作為阿霉素作用MCF-7的聯(lián)合用藥濃度。氟西汀聯(lián)合用藥濃度固定為5μg/ml。兩細(xì)胞經(jīng)10個(gè)藥物處理組:control、PTX(l)、PTX(h)、FLX-PTX(l)、FLX-PTX(h)、ADM(l)、ADM(h)、FLX-ADM(l)、FLX-ADM(h)、FLX處理24h后，AnnexinV-PI染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。采用one-wayANOVA統(tǒng)計(jì)方法，并根據(jù)方差齊性與否采用Dunnett或Dunnett'sT3檢

11、驗(yàn)法進(jìn)行組間多重比較，比較各單獨(dú)用藥組凋亡率與空白組水平差異顯著性，以及t檢驗(yàn)比較各聯(lián)合用藥組與對應(yīng)的單獨(dú)用藥組之間凋亡率表達(dá)水平差異顯著性。
　　 3.Westernblot法從蛋白水平，RT-PCR和qRT-PCR從基因水平進(jìn)行氟西汀作用的機(jī)制研究
　　 各藥物處理組（同上）作用兩細(xì)胞72h后，提取總蛋白用免疫蛋白印跡（Westernblot）方法從分子水平檢測凋亡相關(guān)蛋白p53、Bcl-2蛋白，多藥耐藥蛋白P-gp

12、、GST-π的表達(dá)情況。多藥耐藥基因MDR1mRNA的表達(dá)檢測則是兩細(xì)胞經(jīng)各組藥物處理48h后，提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行半定量RT-PCR(semi-quantitativeRT-PCR)和實(shí)時(shí)定量PCR(quantitativerealtimePCR，qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)。對所有組的目的蛋白及mRNA表達(dá)量以內(nèi)參表達(dá)量進(jìn)行上樣量標(biāo)準(zhǔn)化后，以control組作為對照進(jìn)行歸一，采用one-wayANOVA統(tǒng)計(jì)方法，并根據(jù)方差齊性與否采用Dun

13、nett或可信區(qū)間檢驗(yàn)法比較各單獨(dú)用藥組蛋白和mRNA表達(dá)與空白組水平差異顯著性，以及t檢驗(yàn)比較各聯(lián)合用藥組與對應(yīng)的單獨(dú)用藥組之間蛋白和mRNA表達(dá)水平差異顯著性。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT實(shí)驗(yàn)檢測氟西汀聯(lián)合用藥前后對細(xì)胞活力的影響
　　 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明氟西汀作用MCF-7/ADM和MCF-7細(xì)胞的IC50值分別是25.34±1.3μg/ml和17.56±0.98μg/ml，5μg/ml濃度下MCF-7

14、/ADM和MCF-7細(xì)胞的增值抑制率分別是5.43±2.33％和7.53±0.98％，因此選擇5μg/ml作為氟西汀無細(xì)胞毒性的聯(lián)合用藥濃度。
　　 阿霉素聯(lián)合氟西汀作用MCF-7/ADM細(xì)胞前后IC50值分別是13.62±1.44μg/ml，2.71±0.42μg/ml(P＜0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)RF為5.03。阿霉素聯(lián)合氟西汀作用MCF-7細(xì)胞前后IC50值分別是0.53±0.12μg/ml和0.45±0.

15、04μg/ml，無顯著性差異(P=0.338)。阿霉素單獨(dú)作用耐藥株和敏感株的IC50值相差25.7倍(P＜0.001)。
　　 MCF-7/ADM細(xì)胞中紫杉醇聯(lián)合用藥前后的IC50分別是3.30±0.12μg/ml和2.59±0.11μg/ml(P=0.002)。而MCF-7細(xì)胞中分別是2.11±0.37μg/ml和1.22±0.16μg/ml(P=0.019)，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。紫杉醇單獨(dú)作用耐藥株和敏感株的IC50值統(tǒng)計(jì)

16、結(jié)果具有顯著性差異(P=0.006)。
　　 2.氟西汀增強(qiáng)阿霉素、紫杉醇凋亡誘導(dǎo)作用
　　 流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)藥物處理24h后的細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:MCF-7/ADM細(xì)胞中各組間凋亡率有顯著性差異(F=312.564，P＜0.001)。多重比較顯示與空白組相比，F(xiàn)LX(P=0.161)、ADM(l)(P=0.061)、FLX-ADM(l)(P=0.058)三組凋亡率無顯著差異;其余各組凋亡率均顯著提高(P＜0.05)，凋亡

17、率的提高呈劑量依賴性。t-檢驗(yàn)聯(lián)合氟西汀前后各組凋亡率差異結(jié)果顯示:與單獨(dú)用藥相比，聯(lián)合用藥各組凋亡率均有所上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)LX-PTX(l)組(P=0.001)、FLX-PTX(h)組(P=0.000)、FLX-ADM(l)組(P=0.020)、FXL-ADM(h)組(P=0.025)。
　　 MCF-7細(xì)胞中各組間凋亡率具有顯著性差異(F=1095.432，P＜0.001):多重比較顯示與空白組相比，除氟西汀單獨(dú)用

18、藥組外，其他各處理組凋亡率均顯著提高（均P＜0.05）。聯(lián)合氟西汀前后各組凋亡率差異顯示:FLX-PTX(l)組(P=0.002)、FLX-ADM(l)組(P=0.008)、FLX-PTX(h)組(P=0.007)、FLX-ADM(h)組(P=0.020)與其對應(yīng)的單獨(dú)用藥組相比凋亡率均有提高。
　　 3.Westernblot檢測兩細(xì)胞中p53、Bcl-2、P-gp、GST-π蛋白表達(dá)
　　 3.1.兩細(xì)胞中p53蛋白

19、表達(dá)
　　 MCF-7/ADM細(xì)胞中，One-wayANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析顯示組間蛋白表達(dá)具有顯著性差異(F=792.490，P＜0.001)，與空白組相比，除氟西汀單獨(dú)作用組外(P=0.953)，其余各藥物處理組p53蛋白表達(dá)均有上升，且呈劑量依賴性(均P＜0.001)。與阿霉素、紫杉醇單獨(dú)作用相比，氟西汀聯(lián)合用藥顯著上調(diào)p53的表達(dá)水平，各組均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。
　　 MCF-7細(xì)胞中，One-way

20、ANOVA分析各組p53表達(dá)具有顯著性差異(F=272.446，P＜0.001)。與空白組相比，各藥物處理組p53蛋白表達(dá)均顯著上升，且呈劑量依賴性。與耐藥株相似，與對應(yīng)的單獨(dú)作用相比，聯(lián)合氟西汀后顯著上調(diào)p53的表達(dá)水平，且上調(diào)效果更為明顯。與阿霉素、紫杉醇高濃度單獨(dú)用藥相比，分別8倍和14倍的上調(diào)p53水平（均P＜0.05）。
　　 3.2.兩細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)
　　 MCF-7/ADM細(xì)胞十個(gè)藥物處理組間Bc

21、l-2蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)有顯著性差異(F=57.169，P＜0.001)。與空白組相比，氟西汀單獨(dú)作用Bcl-2蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。阿霉素、紫杉醇單獨(dú)作用MCF-7/ADM細(xì)胞并沒有出現(xiàn)預(yù)期的下調(diào)Bcl-2表達(dá)，反而有所上調(diào)，這種現(xiàn)象紫杉醇低高兩組尤為突出，蛋白表達(dá)的上升均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但氟西汀逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象，使得各聯(lián)合用藥組Bcl-2相對表達(dá)水平均下降到空白組以下，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。
　　 MCF-7細(xì)胞各藥物

22、處理組間Bcl-2蛋白表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=569.921，P＜0.001)。該細(xì)胞株中空白組仍檢測到Bcl-2蛋白的表達(dá)，氟西汀單獨(dú)作用對其無影響。與MCF-7/ADM細(xì)胞不同的是，紫杉醇單獨(dú)作用MCF-7細(xì)胞兩組下調(diào)Bcl-2的表達(dá)至空白組的77％和38.8％，阿霉素引起的下調(diào)較小，分別至空白組的85.6％和72.3％。聯(lián)合氟西汀后，Bcl-2的下調(diào)更為顯著，阿霉素和紫杉醇的聯(lián)合用藥組相對表達(dá)量均分別降到空白組的60％和30％以下，

23、差異有顯著性(均P＜0.05);與其單獨(dú)用藥組相比，差異有顯著性，（均P＜0.05）。
　　 3.3.兩細(xì)胞中P-gp蛋白表達(dá)
　　 MCF-7/ADM細(xì)胞中，各藥物處理組間P-gp的表達(dá)具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=96.914，P＜0.001)?？尚艆^(qū)間檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白組相比，無論單用阿霉素還是阿霉素聯(lián)合應(yīng)用氟西汀，P-gp表達(dá)均無顯著性變化。而紫杉醇單獨(dú)作用使P-gp水平高達(dá)空白組的3.6倍，但聯(lián)合氟西汀后卻下調(diào)至空白組的3

24、0％以下。
　　 MCF-7細(xì)胞中各藥物處理組間P-gp的表達(dá)也具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=146.396，P＜0.001)。與空白組相比，阿霉素單用或聯(lián)合應(yīng)用組蛋白表達(dá)情況與MCF-7/ADM細(xì)胞相似;紫杉醇聯(lián)合氟西汀組與其單獨(dú)作用組相比雖蛋白表達(dá)下調(diào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但相對空白組的表達(dá)量差異不大。
　　 3.4.兩細(xì)胞中GST-π蛋白表達(dá)
　　 MCF-7/ADM細(xì)胞空白組檢測到GST-π的表達(dá)，氟西汀單獨(dú)作用對其表達(dá)無影

25、響(P＞0.05);其余各藥物處理組均引起GST-π的表達(dá)下調(diào)（均P＜0.05），而與對應(yīng)的單獨(dú)用藥相比，氟西汀聯(lián)合用藥組GST-π表達(dá)水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。MCF-7細(xì)胞各組均未檢測到GST-π的表達(dá)。
　　 4.兩細(xì)胞中MDR1基因表達(dá)
　　 經(jīng)one-wayANOVA統(tǒng)計(jì)分析，MCF-7/ADM各藥物處理組間差異有顯著性(F=9.404，P＜0.01)，經(jīng)可信區(qū)間檢驗(yàn)顯示與空白組相比，除F

26、LX組外各單獨(dú)用藥組MDR1表達(dá)均呈上調(diào)態(tài)勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。氟西汀聯(lián)合紫杉醇誘導(dǎo)MDR1基因表達(dá)的下調(diào)，與其對應(yīng)單獨(dú)用藥相比差異有顯著性(P=0.005，P＜0.001)，但與Westernblot結(jié)果不同的是，氟西汀聯(lián)合阿霉素反而引起MDR1基因表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)LX-ADM(l)組上調(diào)明顯，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.030)。MCF-7細(xì)胞中未檢測到MDR1基因的表達(dá)。
　　 qRT-PCR結(jié)果同樣證實(shí)了這一點(diǎn):以MCF-7細(xì)

27、胞的control組為參比，MCF-7/ADM細(xì)胞中MDR1相對表達(dá)量是其的200倍以上，由此可見MCF-7細(xì)胞中MDR1表達(dá)可忽略。而MCF-7/ADM細(xì)胞中MDR1的相對表達(dá)量呈上升趨勢，F(xiàn)LX-ADM(l)相對表達(dá)量是ADM(l)組的2倍，control組的近5倍，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1.無細(xì)胞毒性水平的氟西汀與阿霉素、紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用對MCF-7/ADM和MCF-7細(xì)胞增殖抑