2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩97頁未讀 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、急性髓系白血病(AML)是一類涉及多種形式染色體改變和基因突變的異質(zhì)性惡性腫瘤,克隆性增殖是白血病患者產(chǎn)生異常造血和器官浸潤的必要因素,但目前關(guān)于導(dǎo)致白血病細胞惡性增殖的中間步驟還不完全清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)一種高遷移率族蛋白,高遷移率族蛋白組 A2(high mobility group A2,HMGA2),廣泛參與包括白血病在內(nèi)的人類多種腫瘤的發(fā)生,目前已有文獻報道在白血病細胞中HMGA2的mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達都明顯增高,但是還不

2、了解HMGA2在白血病發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。探索HMGA2所調(diào)節(jié)的信號分子及在白血病發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用對了解白血病發(fā)生的機制是十分重要的,可進一步發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物的相關(guān)靶蛋白,對白血病的靶向治療可能具有一定的意義。
  人類HMGA2基因(過去又被稱為HMGI-C基因),是高遷移率蛋白(high mobility group,HMG)家族成員,因其成員分子量較小,可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中快速遷移而得名,位于人類12號染色體

3、的q15區(qū),由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成,其中外顯子1-3編碼3個DNA結(jié)合區(qū)域,外顯子4編碼DNA結(jié)合區(qū)域和酸性羧基末端之間的間隔區(qū),外顯子5則編碼酸性羧基末端。
  HMGA2蛋白是一種非組蛋白核染色質(zhì)結(jié)合蛋白。一般位于細胞核內(nèi),由109個氨基酸殘基組成,其蛋白氦基端含有3個短的基礎(chǔ)重復(fù)序列編碼結(jié)構(gòu)域,能與DNA分子小溝內(nèi)的AT豐富區(qū)結(jié)合,稱之為AT-hooks結(jié)構(gòu)。HMGA2自身沒有激活或抑制轉(zhuǎn)錄的活性,但可作為構(gòu)筑因子,通

4、過AT-hooks結(jié)構(gòu)與DNA結(jié)合并改變?nèi)旧|(zhì)空間結(jié)構(gòu),通過復(fù)雜的蛋白-DNA、蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),統(tǒng)籌核蛋白復(fù)合物的裝配,從而正向或負(fù)向調(diào)控靶基因的表達。
  HMGA2蛋白在胚胎發(fā)育和細胞分化增殖中發(fā)揮著重要的作用,研究表明在胚胎發(fā)育早期除腦組織外幾乎所有組織都大量表達HMGA2,而在成人組織、分化成熟組織中幾乎檢測不到其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[1]。近年來,越來越多的研究報道發(fā)現(xiàn),多數(shù)腫瘤[2-6]均存在HMGA2過度表達或表現(xiàn)出12

5、號染色體易位導(dǎo)致的HMGA2基因重排的特征,表明HMGA2與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。然而HMGA2在血液系統(tǒng)腫瘤中研究較少,最初有學(xué)者利用常規(guī)RT-PCR方法在急、慢性髓系白血病患者的外周血、健康志愿者及上述患者的CD34陽性造血干細胞中檢測到 HMGA2的表達,研究者認(rèn)為HMGA2在白血病患者中的表達可能是由于異常造血干細胞增殖所致,并有可能成為檢測某些類型白血病的敏感標(biāo)志。此外,有研究報道在發(fā)生Richter轉(zhuǎn)化的慢性淋巴細胞

6、白血病、急性淋巴細胞白血病、原發(fā)性骨髓纖維化、骨髓增生異常綜合征、急性髓系白血病等患者中利用FISH等檢測到 HMGA2的染色體12q13-15區(qū)重排,且認(rèn)為發(fā)生HMGA2重排的患者大多數(shù)預(yù)后不佳。
  RNA干擾技術(shù)是通過雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)高效、特異的阻斷生物體內(nèi)特定基因的表達[7],dsRNA與某些核蛋白形成RISC(RNA-induced silencing complex,RI

7、SC)復(fù)合體,與目的mRNA互補結(jié)合后,RISC能切割目的mRNA,促使 mRNA降解,阻斷蛋白質(zhì)的翻譯,從而關(guān)閉該基因的功能。與傳統(tǒng)的反義技術(shù)相比較,RNA干擾的作用更強大,能作為基因治療的一種工具,在腫瘤、顯性遺傳疾病或感染性疾病中發(fā)揮著重要作用。RNA干擾技術(shù)為進一步揭示白血病的發(fā)病機制提供了有力的工具,基于RNA干擾技術(shù)的基因靶向藥物治療手段極具有應(yīng)用前景。化學(xué)合成的siRNA在細胞內(nèi)所起作用的時間較短,為了達到對靶基因持續(xù)抑制

8、,Brummelkamp等[8]報道了細胞內(nèi)合成的siRAN,一般是由啟動子+siRAN相應(yīng)序列+終止碼組成,在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄后形成發(fā)夾狀短鏈干擾 RNA(small hairpin RNA,shRNA)。其在細胞內(nèi)能持續(xù)抑制靶基因的表達,且持續(xù)時間可達7天以上,并能顯著降低制備 siRNA的成本。目前已有研究證實,21-ntsiRNA能夠特異性抑制哺乳動物體內(nèi)內(nèi)源性基因的表達。以 DNA為基礎(chǔ)的質(zhì)粒載體將siRNAs導(dǎo)入到哺乳細胞內(nèi),但只

9、是瞬時地表達siRNAs,不易得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效果。利用脂質(zhì)體或物理方法如電穿孔直接將siRNAs導(dǎo)入細胞內(nèi),轉(zhuǎn)染效率低下,可能會使細胞的活性喪失。相比較而言,病毒的感染效率高、激發(fā)細胞免疫反應(yīng)的作用弱,是攜帶干擾 RNA的理想載體[9]。因為病毒載體能夠有效地導(dǎo)入siRNA,并且趨向于提供更為穩(wěn)定的基因表達抑制效應(yīng),尤其以慢病毒載體,它不僅可以穩(wěn)定地表達 siRNA,而且還具極高的轉(zhuǎn)染效率和較長時間的持續(xù)干擾效應(yīng)。
  本課題以人

10、急性早幼粒白血病細胞為研究模型,利用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)及RNA干涉技術(shù)手段,研究了HMGA2與白血病細胞惡性克隆性增殖行為的關(guān)系,以揭示HMGA2在白血病發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用,為尋找治療的靶位點和白血病的基因治療提供理論和實驗依據(jù)。
  本研究首先設(shè)計并合成含有干擾HMGA2的雙鏈寡DNA片段及不針對任何mRNA的陰性對照序列DNA片段,與慢病毒載體質(zhì)粒PGCSIL-PUR、PGCSIL-GFP重組形成 shRNA表達載體

11、,經(jīng)測序鑒定獲得連接正確的克隆。在包膜載體 pHelper1.0和pHelper2.0的存在下,通過Lipofectamine TM2000共轉(zhuǎn)染包裝293T細胞獲得攜帶HMGA2基因的RNAi慢病毒HMGA2-RNAi-LV,NC-GFP-LV),然后用重組的慢病毒感染HL-60細胞,以嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定干擾HMGA2基因的細胞株。通過Real time-PCR和Western blotting檢測轉(zhuǎn)染后HL-60細胞中HMGA2的

12、mRNA和蛋白表達的變化,CCK-8法檢測細胞增殖抑制率,軟瓊脂克隆形成實驗檢測細胞增殖能力,F(xiàn)CM檢測細胞周期。RT-PCR及Western blot檢測cyclin B2,cyclin A2在mRNA、蛋白水平的表達。
  本實驗的主要結(jié)果和結(jié)論如下:
  1.成功構(gòu)建了人源HMGA2 siRNA真核表達的重組載體,所構(gòu)建的載體經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、DNA測序證實是正確的。在包膜載體 pHelper1.0和pHelper2.

13、0的存在下,通過Lipofectamine TM2000共轉(zhuǎn)染包裝293T細胞獲得攜帶HMGA2基因的RNAi慢病毒HMGA2-RNAi-LV,NC-GFP-LV),然后用重組的慢病毒以MIO為200的感染指數(shù)感染HL-60細胞,48h后以10ug/ml嘌呤霉素篩選出了穩(wěn)定表達HMGA2 siRNA細胞株,分別命名為:(1)LV-HMGA2shRNA、(2)LV-HMGA2shRNA、(3)LV-HMGA2shRNA和LV-non-sp

14、ecific construct,經(jīng)Western-blot檢測和RT-PCR分析顯示,與正常的HL-60細胞和陰性對照組重組病毒感染的HL-60細胞相比,感染重組LV-HMGA2shRNA病毒在蛋白和mRNA水平顯著地抑制了HMGA2的表達。結(jié)果表明:本實驗成功構(gòu)建了人源HMGA2 siRNA真核表達的重組載體并制備出了重組慢病毒,成功篩選出了穩(wěn)定敲低 HMGA2表達的細胞系,從而為進一步研究 HMGA2在白血病發(fā)生發(fā)展中所起的作用奠

15、定了基礎(chǔ)。
  2.報告基因分析顯示,穩(wěn)定敲低HMGA2并沒有影響報告基因LamininA/C的表達,這說明,敲低HMGA2的表達后在本實驗中沒有產(chǎn)生影響報告基因表達的非特異性反應(yīng),慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾效應(yīng)是能夠特異性地抑制內(nèi)源性HMGA2的表達。
  3.HMGA2的高表達顯著地增加了白血病細胞增殖的能力。本實驗采用CCK-8細胞增殖實驗分析研究了HMGA2對HL-60細胞體外增殖能力的影響。結(jié)果顯示,重組的LV-HMG

16、A2shRNA病毒導(dǎo)入的HL-60細胞增殖率顯著下降。與HL-60細胞和non-specific construct的重組病毒導(dǎo)入的HL-60細胞相比,轉(zhuǎn)染HMGA2-RNAi-LV組細胞的增殖速度明顯減慢,24h即開始分離,轉(zhuǎn)染HMGA2-RNAi-LV組曲線低平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=17.982,P=0.00),HMGA2表達抑制后細胞增殖受抑制。結(jié)果提示HMGA2的高表達顯著地促進了白血病細胞增殖作用。
  4. HMGA

17、2的高表達顯著地增加了白血病細胞克隆形成的能力。軟瓊脂克隆形成實驗顯示與陰性對照組和空白組細胞相比,來自(1)和(3)的HL-60細胞在體外經(jīng)長期培養(yǎng)后只能形成較少的克隆,且克隆也較小,其克隆形成率分別為(42.7±2.8)%、(37.2±4.1)%;而陰性對照組克隆形成率為(70.9±1.8)%、空白組為(73.5±2.1)%;實驗組克隆形成率較陰性對照組和空白組明顯減少,有顯著性差異(F=20.227,P<0.001)。
  

18、5. LV-HMGA2 shRNA對HL-60細胞周期的影響。在來自(1)和(3)的HL-60細胞實驗組中G2/M期的細胞明顯上升,其百分率分別增加到(27.2±3.81)%、(30.1±5.78)%,與陰性對照組細胞、空白組細胞相比較有顯著差異(P<0.05,n=3),結(jié)果表明HMGA2基因表達沉默后對HL-60細胞G2/ M期有阻滯作用。干擾HMGA2表達后的細胞內(nèi)cyclin B2的mRNA和蛋白的相對表達含量,與對照組相比較,明

19、顯下降,轉(zhuǎn)染shRNA1組和shRNA3組的mRNA抑制率分別為(57.31±7.11)%和(67.55±7.69)%,蛋白表達抑制率分別為(51.77±4.81)%和(55.29±3.99)%,P<0.01。而cyclin A2的mRNA和蛋白表達量在各組之間比較無明顯差異。
  綜上所述,慢病毒作為siRNA的攜帶者,不但具備特異性地使基因表達沉默的能力,而且充分發(fā)揮了慢病毒載體自身所具備的優(yōu)勢,為基因功能的研究提供了更強有力

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論