紅藤四萜大環(huán)內酯酸鈉對肝癌的藥效學及作用機制研究.pdf

1、肝癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，90％以上是肝細胞性肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)。近幾十年來，我國HCC的治療盡管取得了長足的進步，手術切除率、術后生存率及生存質量均有較大提高，但與其他腫瘤相比，HCC的療效遠未如人意。肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多基因參與的復雜過程，其具體的發(fā)病機制仍不是十分清楚，肝癌臨床生物學行為較惡、預后極差，其早期肝內轉移以及術后早期復發(fā)的特性直接影響治療方法的選擇及患者

2、的生存質量和生存時間。近年來，伴隨著納米分子醫(yī)學、分子生物學技術突飛猛進的發(fā)展、腫瘤發(fā)生機制的闡明及新的腫瘤治療靶點的發(fā)現等，新型抗腫瘤藥物的開發(fā)以及治療手段的創(chuàng)新和綜合運用都取得了令人可喜的成果。在眾多抗腫瘤藥中，植物單體類抗腫瘤藥所占的比重仍然較大，植物單體類抗腫瘤藥物紫杉醇和多西他賽足以說明植物單體類抗腫瘤藥物在目前腫瘤治療中的重要作用。
　　目的：隨著放、化療藥物的毒副作用等問題愈顯突出，新型高效低毒抗腫瘤藥物的研發(fā)日益受

3、到人們的關注。目前，大環(huán)內酯類藥物在非感染性疾病中的作用研究日趨活躍。紅藤四萜大環(huán)內酯酸鈉是利用聲膜分離技術從天然植物大血藤中提取的單體物質，經成鹽反應得到紅藤四萜大環(huán)內酯酸納（Sargentgloryvinestempolyterpenemacrolideacidsodium，SPMA），其分子式為C38H46O8Na。前期預實驗結果表明該藥物對多種惡性腫瘤細胞具有明顯的抑制增殖和誘導凋亡作用。因此，我們擬通過對紅藤四萜大環(huán)內酯酸鈉的

4、體內外藥效學及一般毒理學研究，明確其抗腫瘤作用及機制，為其進一步的臨床前研究奠定理論基礎，也為獲得一種新型的高效低毒的具有自主知識產權的抗腫瘤藥物奠定實驗基礎。
　　方法：（1）應用不同濃度的紅藤四萜大環(huán)內酯酸鈉作用于肝癌細胞HepG-2和HHCC，通過對細胞生長曲線測定、細胞周期檢測、凋亡檢測以及荷瘤裸鼠抑瘤試驗等，明確紅藤四萜大環(huán)內酯酸鈉的藥效學。（2）應用高通量基因表達譜芯片檢測藥物作用前后基因差異表達情況，通過對差異表達基

5、因所在通路的分析，篩選出紅藤四萜大環(huán)內酯酸鈉誘導肝癌細胞凋亡進而發(fā)揮抑制肝癌細胞生長的主要通路，為進一步闡明其作用機制奠定實驗基礎。（3）針對上述篩選出的通路，通過基因轉染、基因干涉等技術進行各種分子生物學、細胞生物學實驗，證實紅藤四萜大環(huán)內酯酸鈉通過該通路誘導腫瘤細胞凋亡，明確其抗腫瘤作用的靶點。（4）通過對單次給藥前后的SD大鼠血壓和心率的監(jiān)測、連續(xù)給藥一個月的SD大鼠的血常規(guī)和血清各項生化指標的檢測以及連續(xù)給藥大鼠主要臟器的組織切

6、片HE染色觀察，明確紅藤四萜大環(huán)內酯酸鈉在有效抑瘤作用的劑量下是否對機體主要臟器功能造成影響，是否會產生明顯的全身毒副作用。
　　結果：（1）紅藤四萜大環(huán)內酯酸鈉能顯著影響肝癌細胞的生長狀態(tài)、抑制肝癌細胞的增殖，且具有一定的時間和劑量依賴性，但對正常人單個核細胞PBMCs未見明顯生長抑制作用。此外，紅藤四萜大環(huán)內酯酸鈉能阻滯細胞周期于S期，并誘導肝癌細胞HepG-2及HHCC凋亡。體內荷瘤動物實驗顯示紅藤四萜大環(huán)內酯酸鈉能顯著縮小

7、荷瘤鼠的移植瘤體積，并且主要器官的組織切片HE染色未見明顯的病理學變化。（2）通過基因表達譜分析，藥物作用肝癌細胞HepG-2后，差異表達基因共計有4349個，通過對顯著差異表達基因相關通路的Pathway分析，篩選出了兩條紅藤四萜大環(huán)內酯酸鈉抑制肝癌細胞增殖并誘導細胞凋亡的通路：一條為內源性線粒體途徑：bcl-2—線粒體—CeytC—caspase9凋亡通路；另一條為Skp2介導的細胞周期阻滯誘導的凋亡途徑。（3）紅藤四萜大環(huán)內酯酸鈉

8、可下調bcl-xl和mcl-1基因表達，上調bak基因的表達并引起胞漿內細胞色素C蛋白的聚積。（4）通過Skp2干涉載體轉染細胞，下調細胞內Skp2表達后，藥物對細胞的增殖抑制作用明顯降低，細胞未出現明顯的凋亡現象。（5）連續(xù)給藥一個月（每3天一次）后，受試SD大鼠的血常規(guī)及各項主要生化指標均在其參考區(qū)間范圍內，各主要臟器的組織切片HE染色也未見明顯的病理學變化。
　　結論：（1）體內外藥效學實驗證實，紅藤四萜大環(huán)內酯酸鈉能顯著抑

9、制肝癌細胞的增殖并誘導細胞凋亡，且在有效治療劑量范圍內未見對機體產生明顯的毒副作用。（2）紅藤四萜大環(huán)內酯酸鈉能通過下調bcl-2家族中的抑凋亡基因bcl-xl和mcl-1的表達并上調該家族促凋亡基因bak的表達，進而激活內源性線粒體凋亡通路，引起細胞色素C的釋放，進一步激活caspase9而引起肝癌細胞凋亡。（3）紅藤四萜大環(huán)內酯酸鈉可同時以S期激酶相關蛋白Skp2為靶點，引起細胞阻滯于S期，促進細胞凋亡。（4）治療劑量的紅藤四萜大環(huán)