大蒜辣素抗肝癌細胞HepG2體外藥效學及機制研究.pdf

1、大量的研究表明大蒜（garlic）具有殺菌、降血脂、降血壓、抗血栓、抗癌、預防中風、提高機體的免疫力等功效，使之成為近代醫(yī)藥研究熱點之一。關于garlic的功效成分研究主要集中于蒜氨酸及其經(jīng)蒜酶催化裂解產(chǎn)生的大蒜辣素（Allicin）和阿霍烯等系列含硫的化合物。Allicin是新鮮大蒜有效成分提取物，分子式為C6H10OS2。研究表明，Allicin可以降低血清膽固醇和甘油三酯水平，減少動脈粥樣硬化的形成以及血小板的凝集，還具有抑制微生

2、物的作用，同時可以抑制癌細胞增殖及誘導癌細胞凋亡，表現(xiàn)出了腫瘤殺滅作用。已有Allicin對癌細胞生物效應的研究集中于胃癌及腸癌等的研究，對肝癌的研究甚少。本文即研究Allicin對人肝癌細胞HepG2增殖及凋亡的影響，通過探討細胞DNA代謝紊亂及基因表達改變對其在肝癌治療中的藥理作用進行分子學水平的機理探討。 目的：1．研究Allicin對肝癌細胞HepG2增殖及凋亡的影響，確定其對體外培養(yǎng)肝癌細胞最佳的有效藥物濃度和時間范圍

3、及對耐藥基因MDR1表達的影響。 2．通過體外細胞實驗，從分子水平初步探討Allicin對肝癌細胞的作用機制，得到Allicin對肝癌細胞的影響規(guī)律，為其臨床應用的可行性打下基礎。 方法：1．采用HPLC-MS/MS鑒定蒜氨酸與蒜酶酶促反應產(chǎn)物：Allicin，通過制備型HPLC，獲得Allicin的精制品，通過核磁共振光譜技術確證了其化學結(jié)構(gòu)。Allicin含量測定（HPLC法）按歐洲藥典5．0收載“garlic po

4、wder"中采用對照品替代的方法進行測定。 2．孵育細胞過程中以30min為時間間隔吸出細胞培養(yǎng)上清，實驗過程中以未種植細胞培養(yǎng)基加Allicin體系為參照體系。 3．CCK-8檢測細胞增殖情況；流式細胞儀檢測細胞凋亡和DNA周期的變化；Western blot定量檢測Allicin處理前后癌細胞Bc1-2、Bax、Pgp蛋白表達的變化；RT-PCR半定量檢測凋亡相關基因Bc1-2、Bax；耐藥基因MDR1 mRNA表達

5、水平。 結(jié)論：1．肝癌細胞增殖實驗表明Allicin能抑制體外培養(yǎng)細胞增殖，當濃度小于24μg/ml時，對細胞增殖抑制作用隨著濃度的提高增加，當濃度繼續(xù)加大時，對細胞影響未見明顯增加。 2．凋亡及死亡實驗結(jié)果表明，Allicin對肝癌細胞最佳影響濃度范圍為16～24μg/ml，與細胞增殖實驗結(jié)果吻合。 3．DNA周期實驗結(jié)果表明，Allicin能導致細胞DNA代謝發(fā)生紊亂，大量細胞被阻滯于DNA合成的G0/G1期

6、即二倍體期，未進入有絲分裂的預備期四倍體期，進而導致細胞分裂被抑制。并且增殖被抑制后細胞并未停留在G0期而是發(fā)生死亡及凋亡。 4．Western blot實驗結(jié)果表明，Allicin能導致細胞的凋亡基因相關蛋白Bax表達上調(diào)而Bc1-2下調(diào)，細胞凋亡增加，多重耐藥基因MDR1表達下調(diào)，細胞未對Allicin產(chǎn)生耐受。RT-PCR表達水平與蛋白檢測結(jié)果一致。同時人胎肝細胞（Human fetal hepatic cells）對照組