大蒜辣素抗肝癌細(xì)胞HepG2體外藥效學(xué)及機(jī)制研究.pdf

1、大量的研究表明大蒜（garlic）具有殺菌、降血脂、降血壓、抗血栓、抗癌、預(yù)防中風(fēng)、提高機(jī)體的免疫力等功效，使之成為近代醫(yī)藥研究熱點(diǎn)之一。關(guān)于garlic的功效成分研究主要集中于蒜氨酸及其經(jīng)蒜酶催化裂解產(chǎn)生的大蒜辣素（Allicin）和阿霍烯等系列含硫的化合物。Allicin是新鮮大蒜有效成分提取物，分子式為C6H10OS2。研究表明，Allicin可以降低血清膽固醇和甘油三酯水平，減少動脈粥樣硬化的形成以及血小板的凝集，還具有抑制微生

2、物的作用，同時可以抑制癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出了腫瘤殺滅作用。已有Allicin對癌細(xì)胞生物效應(yīng)的研究集中于胃癌及腸癌等的研究，對肝癌的研究甚少。本文即研究Allicin對人肝癌細(xì)胞HepG2增殖及凋亡的影響，通過探討細(xì)胞DNA代謝紊亂及基因表達(dá)改變對其在肝癌治療中的藥理作用進(jìn)行分子學(xué)水平的機(jī)理探討。 目的：1．研究Allicin對肝癌細(xì)胞HepG2增殖及凋亡的影響，確定其對體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞最佳的有效藥物濃度和時間范圍

3、及對耐藥基因MDR1表達(dá)的影響。 2．通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，從分子水平初步探討Allicin對肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制，得到Allicin對肝癌細(xì)胞的影響規(guī)律，為其臨床應(yīng)用的可行性打下基礎(chǔ)。 方法：1．采用HPLC-MS/MS鑒定蒜氨酸與蒜酶酶促反應(yīng)產(chǎn)物：Allicin，通過制備型HPLC，獲得Allicin的精制品，通過核磁共振光譜技術(shù)確證了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。Allicin含量測定（HPLC法）按歐洲藥典5．0收載“garlic po

4、wder"中采用對照品替代的方法進(jìn)行測定。 2．孵育細(xì)胞過程中以30min為時間間隔吸出細(xì)胞培養(yǎng)上清，實(shí)驗(yàn)過程中以未種植細(xì)胞培養(yǎng)基加Allicin體系為參照體系。 3．CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和DNA周期的變化；Western blot定量檢測Allicin處理前后癌細(xì)胞Bc1-2、Bax、Pgp蛋白表達(dá)的變化；RT-PCR半定量檢測凋亡相關(guān)基因Bc1-2、Bax；耐藥基因MDR1 mRNA表達(dá)

5、水平。 結(jié)論：1．肝癌細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明Allicin能抑制體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖，當(dāng)濃度小于24μg/ml時，對細(xì)胞增殖抑制作用隨著濃度的提高增加，當(dāng)濃度繼續(xù)加大時，對細(xì)胞影響未見明顯增加。 2．凋亡及死亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Allicin對肝癌細(xì)胞最佳影響濃度范圍為16～24μg/ml，與細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。 3．DNA周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Allicin能導(dǎo)致細(xì)胞DNA代謝發(fā)生紊亂，大量細(xì)胞被阻滯于DNA合成的G0/G1期

6、即二倍體期，未進(jìn)入有絲分裂的預(yù)備期四倍體期，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞分裂被抑制。并且增殖被抑制后細(xì)胞并未停留在G0期而是發(fā)生死亡及凋亡。 4．Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Allicin能導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡基因相關(guān)蛋白Bax表達(dá)上調(diào)而Bc1-2下調(diào)，細(xì)胞凋亡增加，多重耐藥基因MDR1表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞未對Allicin產(chǎn)生耐受。RT-PCR表達(dá)水平與蛋白檢測結(jié)果一致。同時人胎肝細(xì)胞（Human fetal hepatic cells）對照組