生物發(fā)光分子成像技術(shù)在體監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期的S期.pdf

1、背景與目的：
　　細(xì)胞周期指細(xì)胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個(gè)過(guò)程，包含G1期、S期、G2期、M期四個(gè)階段。S期為DNA合成期，在這一階段完成DNA的合成以及合成與DNA組裝構(gòu)成染色質(zhì)等有關(guān)的組蛋白，此期不僅細(xì)胞DNA含量增加1倍，而且為進(jìn)入有絲分裂提供物質(zhì)，S期正常運(yùn)行是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵。腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的最大區(qū)別就是無(wú)限增殖，干擾DNA的合成阻斷S期，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖現(xiàn)已成多種抗腫瘤藥物的主要作用機(jī)

2、制，可以選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞，而不損害或少損害正常細(xì)胞。然而，在以S期為靶點(diǎn)的新藥研究過(guò)程中，研究者們最關(guān)心的一個(gè)問(wèn)題就是如何在動(dòng)物體內(nèi)有效而簡(jiǎn)捷的監(jiān)測(cè)S期。本研究旨在構(gòu)建反映細(xì)胞周期S期融合報(bào)告基因，實(shí)現(xiàn)利用生物發(fā)光成像技術(shù)無(wú)創(chuàng)地在活體檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。
　　材料和方法：
　　利用Skp2細(xì)胞周期依賴性變化和泛素化依賴性降解的特性，以融合蛋白技術(shù)構(gòu)建Skp2-Luc2基因真核表達(dá)重組載體，通過(guò)共轉(zhuǎn)染方法建立穩(wěn)定表達(dá)Skp

3、2-Luc2及l(fā)uc2的腫瘤細(xì)胞株。采用細(xì)胞周期同步化法檢測(cè)Skp2-Luc2的表達(dá)是否依細(xì)胞周期而調(diào)節(jié)；采用siRNA干擾及蛋白酶體抑制實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證Skp2-Luc2的泛素化依賴性降解途徑；采用在體成像的方法來(lái)檢測(cè)Skp2-Luc2是否可以在體監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期的變化；采用免疫組化的方法來(lái)驗(yàn)證細(xì)胞是否被阻滯的細(xì)胞周期S期。應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　?、賁kp2-luc2

4、的表達(dá)水平隨細(xì)胞周期變化而變化，在S期達(dá)到最高點(diǎn)。
　?、赟kp2-luc2在敲除cdh1及抑制蛋白酶體后積累明顯增加。而luc2未呈現(xiàn)明顯的變化。
　?、跾kp2-luc2熒光素酶活性在S期抗腫瘤藥治療后明顯上調(diào)，而luc2的活性未呈現(xiàn)明顯的變化。
　　④治療組內(nèi)源性skp2與cyclinA的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，而p27的表達(dá)治療組明顯低于對(duì)照組。
　　結(jié)論：
　　成功的構(gòu)建了細(xì)胞周期S期的報(bào)告基因Skp