模式識別受體激動劑poly(I-C)誘導胃癌細胞凋亡及逆轉(zhuǎn)免疫耐受作用機制研究.pdf

1、研究目的:
　　 根據(jù)WHO統(tǒng)計，胃癌已經(jīng)成為世界上第二常見的惡性腫瘤，尤其是在亞洲地區(qū)，嚴重危脅著人類健康。相比手術(shù)、放療及化療等傳統(tǒng)的治療方法，生物治療被認為是一種有潛力的治療方法。但是由于技術(shù)、費用等的限制，生物治療在臨床上應用仍有一定的困難。因此急需新的生物治療手段和藥物的研發(fā)，為胃癌的預防與治療提供新的策略。
　　 越來越多的研究證實，模式識別受體(patternrecognitionreceptors，PRR

2、s)不僅表達在免疫細胞中，在各種實質(zhì)細胞，包括腫瘤細胞中也有廣泛的表達，且表達譜各異，這就提示在非免疫細胞中PRR活化傳遞了不同于內(nèi)源性免疫激活過程的分子事件。有關(guān)研究提示，這些PRR在腫瘤發(fā)生中的作用可能是把雙刃劍，即在不同的腫瘤細胞和組織中，不同的PRR的激活可以產(chǎn)生完全不同的生物學效果，有的可以促進腫瘤細胞生存，有的則明顯抑制腫瘤細胞存活。
　　 TLR3在細胞膜和內(nèi)吞溶酶體均有表達，可識別dsRNA以及其類似物多聚次黃嘌

3、呤多聚胞嘧啶核苷酸poly(I:C)，產(chǎn)生抗病毒反應。同時，表達在細胞內(nèi)的胞漿RNA受體RLR也可以識別dsRNA和poly(I:C)，誘導Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。Poly(I:C)在腫瘤免疫治療中的作用已被廣泛論證。Poly(I:C)不僅能夠作為免疫佐劑用于臨床治療，而且還可以直接誘導多種腫瘤的凋亡。然而，在胃癌細胞中，通過不同方式輸送poly(I:C)對癌癥發(fā)展進程的影響仍不清楚。本研究通過探索poly(I:C)對胃癌細胞的腫瘤行為影響，

4、有助于了解激活腫瘤細胞PRR后的腫瘤生物學行為的更多分子細節(jié)，評價poly(I:C)用于胃癌生物治療的可行性，為設(shè)計和利用基于PRR的抗腫瘤治療藥物提供有益的啟示。
　　 研究方法:
　　 首先，以胃腺癌細胞系A(chǔ)GS和BGC-823細胞為模型，采用半定量RT-PCR檢測TLR1-TLR10mRNA基礎(chǔ)表達水平;MTT法、CCK-8法、EdU摻入法檢測poly(I:C)對胃癌細胞的增殖能力的影響;MTT法、CFSE-7-A

5、AD法評價NK細胞對poly(I:C)處理后的胃癌細胞殺傷能力的影響;實時定量PCR檢測細胞因子mRNA水平的變化;流式細胞術(shù)檢測TLR3、CyclinD1、MICA/B、ULBP2、CD54、Fas表達水平以及NKL細胞中CD107a、Perforin和TNF-α的分泌水平。
　　 然后，利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將poly(I:C)轉(zhuǎn)染入胃癌細胞內(nèi)，AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡;實時定量PC

6、R法檢測RLRs、Ⅰ型干擾素通路關(guān)鍵基因以及炎癥因子的表達水平;siRNA分別沉默三種RLR受體;Western-blot檢測NF-κB的活化;用干擾素受體阻斷實驗和外加干擾素實驗檢測Ⅰ型干擾素在poly(I:C)介導的細胞凋亡中的作用;分別用實時定量PCR和FACS檢測凋亡相關(guān)分子Bcl-2家族基因mRNA和蛋白水平改變;構(gòu)建pLMP-anti-Drosha質(zhì)粒，檢測沉默microRNA后，poly(I:C)對細胞凋亡的作用。通過建立

7、BGC-823裸鼠腫瘤異種移植模型，觀察poly(I:C)對腫瘤生長的抑制作用。
　　 最后，轉(zhuǎn)染poly(I:C)后，MTT法檢測NK細胞對胃癌細胞的殺傷能力以及流式細胞術(shù)分析胃癌細胞表面殺傷相關(guān)配體的表達水平。同時，用轉(zhuǎn)染poly(I:C)后的腫瘤細胞上清孵育NK細胞，MTT法檢測NK細胞的增殖、殺傷能力，Transwell實驗檢測遷移能力，流式細胞術(shù)分析脫顆粒能力、殺傷相關(guān)受體表達水平、以及促炎因子的分泌情況。
　　

8、 實驗結(jié)果:
　　 (1)胞外poly(I:C)可抑制胃癌細胞的增殖，這一過程的主要分子特征是DNA合成能力減弱、CyclinD1的表達水平降低，炎癥因子mRNA的表達水平下降;同時，NK細胞對于poly(I:C)處理后的胃癌細胞的殺傷功能增強，NK細胞分泌CD107a、perforin、TNF-α的能力提高。
　　 (2)轉(zhuǎn)染poly(I:C)后，體外觀察到了明顯的促胃癌細胞凋亡作用，且體內(nèi)可以有效的抑制腫瘤的生長。

9、這種促凋亡作用依賴于RLR的活化，但是不依賴于TLR3和PKR，并且Ⅰ型干擾素不參與直接的誘導凋亡效應。進一步研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族也許在促凋亡過程中起作用。
　　 (3)Poly(I:C)處理后的胃癌細胞對于NK細胞的殺傷敏感性增強，同時伴隨著NK細胞活化性受體NKG2D配體MICA/B和Fas的表達上調(diào)，NKG2A抑制性配體HLA-ABC的表達下調(diào)。對poly(I:C)處理后的胃癌細胞上清孵育NK細胞研究發(fā)現(xiàn)，NK細胞的增殖

10、、遷移以及殺傷能力均有所增強，同時活化性受體及殺傷相關(guān)分子表達上調(diào)。進一步實驗證實，NK細胞的活化依賴于poly(I:C)刺激后胃癌細胞產(chǎn)生的大量Ⅰ型干擾素。
　　 結(jié)論及意義:
　　 胞外poly(I:C)可直接抑制腫瘤的生長并提高胃癌細胞對NK細胞殺傷的敏感性;胞內(nèi)poly(I:C)不僅具有直接的促凋亡作用，而且可以通過改善腫瘤微環(huán)境增強天然免疫應答，逆轉(zhuǎn)機體的免疫抑制狀態(tài)。免疫刺激性RNA分子的合理應用，著眼于調(diào)動