重組肌肉生長(zhǎng)抑制素的制備及主動(dòng)免疫生長(zhǎng)豬的研究.pdf

1、本文通過分子生物學(xué)手段獲得了豬MSTN全長(zhǎng)DNA片段，構(gòu)建了克隆載體，并在大腸桿菌中融合表達(dá)了豬的MSTN蛋白。利用MSTN蛋白作為抗原，注射免疫生長(zhǎng)豬，目的是為了阻斷其生理效應(yīng)從而提高動(dòng)物產(chǎn)肉率，同時(shí)為今后開展其他外源基因的原核表達(dá)研究提供技術(shù)支持。 首先，根據(jù)基因庫(kù)肌肉生長(zhǎng)抑制素基因序列設(shè)計(jì)合成特異性引物，引物兩端分別加上EcoR I和Sal I酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，提取漢普夏豬的骨骼肌總RNA，用RT-PCR方法擴(kuò)增肌肉生長(zhǎng)

2、抑制素全長(zhǎng)基因，并將其克隆到pMD18-T載體上，測(cè)序后EcoR.I和Sal I雙酶切，克隆到pET-30a中，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30a-M，將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)。成功擴(kuò)增出肌肉生長(zhǎng)抑制素全長(zhǎng)基因；克隆載體經(jīng)過DNA序列測(cè)定，所得基因與國(guó)外報(bào)道的完全一致；成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30a-M；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)， SDS-PAGE電泳結(jié)果證明產(chǎn)物約48ku，與預(yù)期大小相符。對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)

3、化，確定最佳表達(dá)條件為IPTG 0.4mmol/L,誘導(dǎo)時(shí)間為6h。將菌體進(jìn)行超聲破碎、SDS。PAGE檢測(cè)表明，研究發(fā)現(xiàn)MSTN在大腸桿菌中的表達(dá)主要以包涵體的形式存在。采用包涵體純化的方法對(duì)蛋白進(jìn)行粗提純，然后利用重組蛋白6個(gè)連續(xù)的組氨酸，采用金屬螯合親和層析純化重組蛋白，得到純化的目的蛋白。 利用獲得的重組肌肉生長(zhǎng)抑制素蛋白主動(dòng)免疫生長(zhǎng)育肥豬，考察重組蛋白對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能和肉用品質(zhì)的影響。試驗(yàn)選用25+1.5kg健康三元(

4、DLY)雜交豬27頭，按體重相近的原則隨機(jī)分成3個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭豬，在試驗(yàn)第1、15、29d分別注射生理鹽水和不同劑量的重組蛋白。試驗(yàn)第49天每個(gè)重復(fù)選1頭豬進(jìn)行屠宰試驗(yàn)。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，免疫M(jìn)STN蛋白高劑量組、低劑量組豬在生產(chǎn)性能改善方面均呈現(xiàn)出明顯的階段性效應(yīng)：3-4周低劑量組飼料效率提高，飼料轉(zhuǎn)化率高于對(duì)照組。5-6周低劑量和高劑量組在平均日增重、飼料轉(zhuǎn)化率都高于對(duì)照組。在胴體性狀方面，高劑量組比對(duì)