電離輻射致內耳毛細胞放射性損傷機制的初步研究以及鼻咽癌放療后內耳聽力損傷的臨床分析.pdf

1、研究背景和目的：
　　 目前放療安全性得到了放療工作者的廣泛關注，2010年3月國際放療權威雜志《IntJRadiatOncolBiolPhys》發(fā)表了《正常組織效益臨床定量分析》(QUANTEC)指南，指出了放射治療中內耳等16個不同器官受輻射后存在晚期損傷。鼻咽癌是我國常見惡性腫瘤之一，尤以華南地區(qū)發(fā)病率最高，僅廣東省的年發(fā)病率就高達30/萬以上。鼻咽癌放療治愈率高，較多患者能夠長期生存，然而在鼻咽癌放射治療時，聽覺系統(tǒng)常被

2、包括在高劑量照射野內，其中內耳的放射性損傷多為晚期不良反應，常表現(xiàn)為感音神經(jīng)性聽力下降(sensorineuralhearingloss，SNHL)，通常在放療結束后6至12月內發(fā)生。文獻報道鼻咽癌放療晚期SNHL發(fā)生率高達50％以上，而目前對于SNHL尚無有效治療方法，它不僅阻礙患者社會交往活動，甚至能發(fā)展成為耳聾，對患者認知功能、心理情緒等也造成不良后果，嚴重影響鼻咽癌患者的生存質量。
　　 由于內耳體積較小且結構精細，其放

3、療相關生理、生化方面研究報道甚少;耳蝸毛細胞作為內耳感覺神經(jīng)的終末細胞，是產(chǎn)生正常聽力的基本功能單元，有關其放射損傷機制方面的研究更是鮮有報道。而且有關內耳放療損傷回顧性臨床研究特別是調強放療治療模式下鼻咽癌放療后內耳聽力損傷的臨床分析數(shù)據(jù)并不多。因此，開展一系列內耳放射損傷機制的研究，結合鼻咽癌放療晚期內耳聽力損傷的臨床觀察，是極具中國特色、地域價值和意義的。
　　 本研究首先通過射線照射耳毛細胞株HEI-OC1，并從細胞增殖

4、、DNA損傷、細胞周期、細胞凋亡等方面證實耳毛細胞發(fā)生放射性損傷，然后采用miRNA芯片分析正常耳毛細胞與發(fā)生放射損傷的耳毛細胞株之間miRNA表達譜差異，篩選差異表達miRNAs，進行生物信息學分析，并初步探討了miR-207在耳毛細胞放射損傷中的作用;然后，使用丹參酮ⅡA對耳毛細胞株的放射損傷模型進行干預，來觀察其對HEI-OC1放射性損傷的保護作用，并初步探討可能的保護機制;最后從臨床的角度，通過聽力學檢測觀察鼻咽癌病人行根治性調

5、強放療后內耳聽力損傷現(xiàn)狀，并結合病人年齡、性別、疾病分期、內耳受照劑量以及是否同步化療等因素進行多因素回歸分析，尋找放療晚期SNHL發(fā)生的可能的危險相關因素，為臨床上防治放療晚期SNHL的發(fā)生發(fā)展提供新思路及實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、耳毛細胞株HEI-OC1放射損傷模型的建立及其miRNA表達譜差異分析。采用不同劑量的高能X線照射，通過MTT檢測細胞增殖能力、免疫熒光檢測細胞內DNA損傷標志γH2AX、流式細胞

6、儀檢測細胞周期及細胞凋亡確定耳毛細胞株發(fā)生放射性損傷。然后通過miRNA芯片檢測發(fā)生放射性損傷的耳毛細胞株與正常耳毛細胞株的miRNA表達譜，篩選出差異表達miRNA，并采用QRT-OCR進行驗證，挑選mir-207做進一步的生物信息學分析，預測靶基因及靶基因功能分類，然后通過轉染方法，過表達以及抑制mir-207的表達，觀察其表達異常對HEI-OC1細胞增殖能力的影響。
　　 2、丹參酮ⅡA對放射引起的耳毛細胞株HEI-OC1

7、損傷的保護作用。首先用不同濃度的丹參酮ⅡA作用于HEI-OC1細胞，通過MTT法檢測細胞增殖能力，證明丹參酮ⅡA無耳毒性副作用。然后將細胞分組為對照組(0Gy)、照射組(16Gy)以及加藥組(16Gy+TanⅡA)，通過MTT法檢測細胞增殖能力，流式細胞儀檢測細胞凋亡，免疫熒光檢測細胞內γH2AX與P65共定位，QRT-PCR以及免疫印跡法檢測細胞凋亡相關調控因子的表達情況。
　　 3、分別于放療前、放療后1個月、6個月以及放療

8、后1年檢測鼻咽癌病人的純音聽閾、聽性腦干反應以及畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射等聽力學指標，評價鼻咽癌病人放療后的聽力狀況，然后通過對包括性別、年齡、TNM分期、內耳照射劑量以及是否同步化療在內的5個因素進行回歸分析，以探討鼻咽癌放療晚期SNHL發(fā)生的可能危險因素。
　　 統(tǒng)計學處理：
　　 使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1、經(jīng)射線照射后，MTT檢測結果

9、顯示耳毛細胞株HEI-OC1的增殖能力隨射線照射劑量的增高而減弱;γH2AX的檢測發(fā)現(xiàn)隨著照射劑量的增高，HEI-OC1細胞中DNA雙鏈斷裂程度加重，并且劑量越高，其DNA損傷修復減緩，甚至不能完全修復;細胞周期檢測結果則提示射線照射后細胞周期分布會出現(xiàn)G2期細胞比例隨照射劑量增加而增多的趨勢，且細胞凋亡百分比也隨著照射劑量的增加而增加。
　　 2、通過miRNA表達譜分析，篩選出在照射后表達下調的miRNA有9個，表達上調的有

10、3個。QRT-PCR對其中部分miRNA進行了驗證，結果顯示mmu-miR-101a*，mmu-miR-375*,mmu-miR-491*,mmu-miR-92a-1*，mmu-miR-207，mmu-miR-466i-5p的表達與芯片結果基本一致。選取表達差異倍數(shù)最大的mmu-miR-207進行進一步的分析，通過靶基因預測以及Go分類分析，發(fā)現(xiàn)其靶基因主要涉及細胞凋亡調控、細胞周期及其相關蛋白激酶的調控、細胞增殖的調控、DNA損傷的應

11、答機制以及神經(jīng)發(fā)育等多種生物過程。用mir-207的mimics和inhibitor轉染HEI-OC1細胞，并通過QRT-PCR驗證轉染效率，然后用MTT檢測轉染前后細胞增殖能力的改變，結果顯示過表達mir-207使耳毛細胞的放射性損傷程度加重，而抑制其表達未能改變耳毛細胞的放射損傷程度。
　　 3、通過MTT實驗證實了加入丹參酮ⅡA可以減弱射線照射對HEI-OC1細胞增殖能力的損傷以，流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可以減少射線誘導

12、的細胞凋亡，而免疫熒光共定位結果顯示，丹參酮ⅡA能阻止放射誘導的耳毛細胞株中的P65/NF-κB的核內轉位過程，并通過QRT-PCR和免疫印跡法發(fā)現(xiàn)了細胞凋亡相關蛋白AKT和P21在丹參酮ⅡA干預下，其表達與單純放射組相比有差異，因此丹參酮ⅡA可能通過抑制射線誘導的AKT的表達下調以及P21的表達上調，使細胞對射線抵抗力增強。
　　 4、臨床研究顯示:通過檢測鼻咽癌病人放療前后純音聽閾，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌放療后聽力損傷中，高頻區(qū)聽力損傷

13、較低頻區(qū)出現(xiàn)早（放療后1個月高頻聽閾平均提高了15.00dB，而低頻區(qū)平均升高1.69dB），且損傷程度隨時間的延長而加重（放療后1年，高頻聽閾平均提高20.65dB，低頻區(qū)為17.91dB）。放療后1年SNHL的發(fā)生率為57.45％(54/94)。聽性腦干反應的檢查結果提示鼻咽癌患者放療后聽神經(jīng)通路無明顯損傷。而反映耳蝸外毛細胞功能的畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)檢查顯示放療后發(fā)生SNHL患者的DPOAE幅值較放療前明顯下降，說明外毛

14、細胞發(fā)生了放射性損傷進而影響了耳蝸聽力放大的正常功能。經(jīng)多因素回歸分析，結果提示病人就診時年齡偏大、TNM分期以及聯(lián)合同步順鉑化療是放療后SNHL發(fā)生的危險因素。
　　 結論：
　　 1、X線照射可以抑制耳毛細胞株HEI-OC1增殖，造成細胞內DNA雙鏈斷裂，誘導細胞發(fā)生G2/M期阻滯以及細胞凋亡;
　　 2、照射后HEI-OC1細胞miRNA表達譜發(fā)生變化，其中miR-207的過表達加重了HEI-OC1細胞的放