循環(huán)RNA檢測及對胃癌診療的意義.pdf

1、目的：建立微量核酸的巢式定量PCR檢測技術，并運用該技術檢測血漿或培養(yǎng)細胞上清中細胞外循環(huán)RNA分子。通過創(chuàng)建細胞饑餓、缺氧、低溫、藥物干預等模型探討循環(huán)RNA在腫瘤患者異常增高的原因及其對臨床胃癌診斷、治療的意義。 方法：聯合運用Trizol試劑與離心吸附柱方法提取血漿或培養(yǎng)細胞上清中微量循環(huán)RNA，建立基于SYBR green Ⅰ的巢式定量PCR檢測微量RNA的技術。探討體外胃癌細胞株(SGC7901)經血清饑餓、缺氧、低溫

2、培養(yǎng)后，上清細胞外RNA的變化規(guī)律，以此初步分析腫瘤患者循環(huán)RNA異常增高的原因。細胞經5-氟尿嘧啶、順鉑作用后，定時觀察培養(yǎng)上清RNA的變化，以此推斷循環(huán)RNA對腫瘤患者化療的監(jiān)測價值。同時分別對胞內與胞外β-actin基因相對表達水平進行比較。通過過濾實驗及RNase抵抗實驗判斷循環(huán)RNA對RNase的抵抗力，初步分析其可能的一些生物學性質。體內聯合檢測手術前和手術后的胃癌患者及健康人外周血循環(huán)CXCR4和Bmi-1基因表達水平以及

3、血漿CEA、CA19-9含量，結合胃癌患者臨床資料研究其對胃癌診斷、治療的意義。 結果：聯合運用Trizol-離心柱技術成功分離出血漿循環(huán)RNA分子，巢式定量PCR檢測微量RNA線性良好，且敏感性達到100～1copies/μl。SGC細胞經血清饑餓、低溫處理后一定時期內上清RNA較對照組顯著降低，而缺氧組細胞上清RNA含量在48小時后較對照組明顯升高。腫瘤細胞經抗瘤藥作用48小時后，大部分細胞死亡，上清RNA含量略上升但不明顯

4、，剩余細胞經反復換液徹底移去殘留藥物后，上清RNA含量較藥物作用前及對照組均顯著降低。同等量的胞內與胞外RNA經同步逆轉錄PCR后，β-actin胞外表達水平顯著低于胞內表達水平。培養(yǎng)細胞上清經0.22μm濾膜過濾后濾液RNA含量顯著低于過濾前及粘附于濾膜上的RNA含量，濾液、濾膜及濾前上清RNA均能抵抗RNase的降解而提純游離的SGC胞內RNA經RNase作用后被完全降解。胃癌患者外周血漿循環(huán)CXCR4、Bmi-1基因及CEA、CA

5、19-9蛋白表達顯著高于健康人?；颊呓浭中g后表達下降。血漿CXCR4、Bmi-1表達與患者年齡、分期、分化程度、是否轉移等因素有關?；虻穆摵蠙z測能有效提高診斷的敏感性和準確率，且診斷價值優(yōu)于CEA、CA19-9的組合。 結論：巢式熒光定量PCR是一種敏感的檢測微量核酸的方法。缺氧與較高的代謝水平是導致腫瘤細胞釋放循環(huán)RNA增加的重要原因。循環(huán)RNA對RNase有一定的抵抗力。外周血循環(huán)RNA腫瘤相關基因的檢測對腫瘤的診斷及治療