自體及健康人CIK細胞對比治療惡性腫瘤的初步評估研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　腫瘤的有效治療是醫(yī)學領(lǐng)域最難攻克的難題之一。近年來,隨著對免疫系統(tǒng)及其功能的深入研究,過繼性細胞免疫治療(adoptive cellular transfer immunotherapy,ACT)成為繼手術(shù)、化療以及放療等臨床常規(guī)治療方法外第4種腫瘤治療的有效方式。ACT是指向腫瘤患者體內(nèi)輸注具備抗腫瘤活性的免疫細胞以激活機體抗瘤免疫應答或直接殺傷腫瘤細胞,從而達到治療腫瘤的目的。
　　細胞因子誘導的殺

2、傷細胞(cytokine-induced killer cells, CIK)在1991年由Schmidt-Wolf等發(fā)現(xiàn),是臍血或外周血來源的單個核細胞在體外經(jīng)一系列細胞因子刺激及誘導擴增得到的一群異質(zhì)細胞,主要發(fā)揮殺瘤作用的是CD3+CD56+細胞。與早期用于 ACT治療的免疫細胞,如淋巴因子活化的殺傷細胞(lympokine activated killer cells,LAK)、腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrati

3、ng lymphocytes,TIL)、細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)以及抗 CD3單克隆抗體激活的殺傷細胞(anti-CD3 monoclonal antibody activated killer cells,CD3AK)等相比,CIK細胞具備體外擴增效率高、抗瘤活性強、毒副反應小并且對多藥耐藥腫瘤細胞同樣敏感等優(yōu)點,已經(jīng)在臨床多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤及惡性實體腫瘤的治療中取得了可喜的效果,

4、成為目前ACT治療的研究熱點。
　　現(xiàn)在臨床主要通過采集腫瘤患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)行體外誘導收獲CIK用于細胞過繼治療,但研究表明患者自體CIK細胞過繼治療對惡性實體腫瘤的總體有效性僅為30％左右;除患者自體CIK外,健康人來源的同種異體CIK細胞由于其易于獲得、毒副作用小的特點被用于部分年老體弱患者的治療,然而目前尚無關(guān)于腫瘤患者自體以及健康人CIK

5、細胞在體外增殖能力、抑瘤活性以及臨床治療效果差異的系統(tǒng)比較。
　　此外,CIK回輸患者體內(nèi)后在體內(nèi)的存活周期也是影響 ACT治療效果的重要因素,但目前尚無關(guān)于此方面的確切文獻報道。本實驗的研究目的即是通過比較惡性腫瘤患者和健康人來源的CIK細胞在體外增殖能力、抑瘤活性以及臨床治療效果的差異,并初步分析健康異體CIK細胞回輸患者體內(nèi)后的存活時間,以期為臨床實施CIK細胞過繼治療提供一定的依據(jù)和經(jīng)驗。
　　方法:
　　第一

6、部分:腫瘤患者自體及健康人CIK細胞的體外分離培養(yǎng)
　　1. Ficoll密度梯度離心法分離腫瘤患者及健康人 PBMC,在體外經(jīng)干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、抗CD3單克隆抗體(OKT3 monoclonal antibody,OKT3)、重組人白細胞介素-1(recombinant human interleukin-1,rhIL-1)以及重組人白細胞介素-2(recombinant human inter

7、leukin-2,rhIL-2)誘導培育CIK細胞;
　　2.應用0.04%臺盼蘭拒染法計數(shù)培育3 d、7 d及14 d時腫瘤患者CIK及健康人CIK細胞,分析體外增殖能力;
　　3.應用流式細胞術(shù)檢測培育3 d、7 d及14 d時腫瘤患者CIK及健康人CIK細胞中CD3+CD56+表型變化。
　　第二部分:腫瘤患者自體及健康人CIK細胞體外抑制HCT116和 HepG2并影響其Bcl-2/Bax表達的初步比較

8、　　1.以人結(jié)腸癌細胞株HCT116和肝癌細胞株HepG2為靶細胞,設(shè)置效靶比(ratio of effector cells to target cells,E/T)為5:1、10:1、20:1和40:1,分別取培育14 d時腫瘤患者CIK及健康人CIK細胞處理24 h后通過細胞增殖、毒性檢測試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)檢測其對靶細胞的抑制活性,以正常PBMC處理的靶細胞為對照組;
　　2.以人結(jié)

9、腸癌細胞株HCT116和肝癌細胞株HepG2為靶細胞,設(shè)置效靶比為40:1,分別取培育14 d時腫瘤患者CIK及健康人CIK細胞處理48h后通過Western Blot檢測靶細胞中B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)以及Bcl-2相關(guān)X基因(Bcl-2 associated X,Bax)表達情況并計算Bcl-2/Bax,以正常PBMC處理的靶細胞為對照組。
　　第三部分:腫瘤患者接受自體或健康人

10、CIK治療后近期療效比較以及健康男性CIK在女性患者體內(nèi)存活周期的初步研究
　　1.取患者接受自體或健康異體 CIK細胞治療后不同時間點外周血樣本,通過流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞亞群水平,以健康人淋巴細胞亞群水平為對照;
　　2.以Karnofsky功能狀態(tài)評分(karnofsky performance status,KPS)、數(shù)字疼痛評分法(numerical rating scale,NRS)和體重變化作為主要評估指標,評

11、估患者接受自體或健康異體CIK細胞治療后臨床收益反應(clinical benefit rate,CBR);
　　3.觀察記錄CIK治療期間毒副反應,如發(fā)熱、皮疹等不適;
　　4.取8例接受男性親屬CIK細胞治療女性不同時間點的外周血樣本,提取DNA行常規(guī)PCR,對Y染色體性別決定基因(sex determining region of Y chromosome,Sry)行初步定性分析。
　　結(jié)果:
　　第一部分

12、:腫瘤患者自體及健康人CIK細胞的體外分離培養(yǎng)
　　1.臺盼蘭拒染法結(jié)果顯示培育3 d、7 d及14 d時健康人CIK細胞增殖快于腫瘤患者CIK細胞;
　　2.流式細胞術(shù)檢測培育3 d、7 d及14 d時CIK細胞CD3+CD56+表型變化,結(jié)果顯示同時期健康人CIK細胞中CD3+CD56+比例高于腫瘤患者CIK細胞。
　　第二部分:腫瘤患者自體及健康人CIK細胞體外抑制HCT116和 HepG2并影響其Bcl-2/B

13、ax表達的初步比較
　　1.CCK-8檢測腫瘤患者自體 CIK細胞、健康人 CIK細胞以及健康人 PBMC對HCT116和HepG2的抑制能力,結(jié)果顯示這3組細胞均可不同程度抑制腫瘤細胞,在同一種效應細胞作用時,效應細胞的抑瘤作用隨效靶比的升高而增加;在同一效靶比下,健康人 CIK細胞的體外抑瘤活性要強于腫瘤患者自體 CIK細胞,而正常 PBMC的抑瘤作用相對較弱;
　　2.Western Blot檢測腫瘤患者自體CIK細胞

14、、健康人CIK細胞以及健康人PBMC處理后HCT116和HepG2中Bcl-2及Bax表達情況,結(jié)果顯示這3組細胞處理后的腫瘤細胞 Bcl-2、Bax表達情況均有改變,Bax表達不同程度上調(diào),Bcl-2表達不同程度下調(diào),Bcl-2/Bax比值呈現(xiàn)降低趨勢,其中健康人 CIK細胞引起的這一效應最強,正常PBMC處理組相對較弱,而腫瘤患者自體CIK處理組介于2者之間。
　　第三部分:腫瘤患者接受自體或健康人 CIK治療后近期療效比較以

15、及健康男性CIK在女性患者體內(nèi)存活周期的初步研究
　　1.流式細胞術(shù)檢測患者接受 CIK細胞治療后淋巴細胞亞群水平,以健康人淋巴細胞亞群水平為對照,結(jié)果顯示 CIK細胞過繼治療后24例患者免疫功能均有不同程度改善,其中健康異體CIK細胞治療組12例患者總CD3+ T、CD4+/CD8+比值改善較自體CIK細胞治療組更快且持續(xù)時間較長;
　　2.接受自體CIK細胞或健康異體CIK細胞治療后60 d的2組患者在KPS評分、NRS

16、評分和體重變化這3個主要評估指標以及總體的CBR上無明顯差異;
　　3.觀察期間24例患者均未出現(xiàn)嚴重的毒副反應;
　　4.接受男性親屬CIK治療的8例女性患者在治療后均可檢測到Sry基因條帶,其強弱隨時間逐漸減弱直至消逝,平均持續(xù)時間為(7.0±0.93) w。
　　結(jié)論:
　　本課題初步探討了12例惡性腫瘤患者自體及12例健康人來源的CIK細胞在體外增殖能力、抑瘤活性及臨床近期療效的差異,并通過對8例接受男性

17、親屬CIK治療的女性患者外周血Sry基因水平行初步定性分析以評估CIK細胞在患者外周血的存活時間:
　　一、在體外培育過程中,健康人 CIK細胞較腫瘤患者 CIK細胞增殖速度快且CD3+CD56+比例較高;
　　二、腫瘤患者自體CIK細胞、健康人CIK細胞以及健康人PBMC在體外均可不同程度抑制 HCT116和 HepG2,其中健康人 CIK細胞抑瘤活性較腫瘤患者自體 CIK細胞強,而健康人PBMC抑瘤活性相對較弱;進一步實

18、驗表明,這3組細胞均可通過上調(diào)腫瘤細胞Bax、抑制其Bcl-2表達水平介導靶細胞的凋亡,其中健康人CIK細胞作用最強,腫瘤患者自體CIK細胞次之,健康人PBMC作用相對較弱;
　　三、接受CIK細胞過繼治療后,24例患者免疫功能均有不同程度改善,其中健康異體CIK細胞治療組免疫狀況改善較自體CIK細胞治療組更快且持續(xù)時間較長;2組患者在治療后60 d的KPS評分、NRS評分和體重變化以及總體的CBR上無明顯差異,均未出現(xiàn)嚴重的毒副