自體及健康人CIK細(xì)胞對比治療惡性腫瘤的初步評估研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　腫瘤的有效治療是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最難攻克的難題之一。近年來,隨著對免疫系統(tǒng)及其功能的深入研究,過繼性細(xì)胞免疫治療(adoptive cellular transfer immunotherapy,ACT)成為繼手術(shù)、化療以及放療等臨床常規(guī)治療方法外第4種腫瘤治療的有效方式。ACT是指向腫瘤患者體內(nèi)輸注具備抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞以激活機(jī)體抗瘤免疫應(yīng)答或直接殺傷腫瘤細(xì)胞,從而達(dá)到治療腫瘤的目的。
　　細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺

2、傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cells, CIK)在1991年由Schmidt-Wolf等發(fā)現(xiàn),是臍血或外周血來源的單個核細(xì)胞在體外經(jīng)一系列細(xì)胞因子刺激及誘導(dǎo)擴(kuò)增得到的一群異質(zhì)細(xì)胞,主要發(fā)揮殺瘤作用的是CD3+CD56+細(xì)胞。與早期用于 ACT治療的免疫細(xì)胞,如淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞(lympokine activated killer cells,LAK)、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrati

3、ng lymphocytes,TIL)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)以及抗 CD3單克隆抗體激活的殺傷細(xì)胞(anti-CD3 monoclonal antibody activated killer cells,CD3AK)等相比,CIK細(xì)胞具備體外擴(kuò)增效率高、抗瘤活性強(qiáng)、毒副反應(yīng)小并且對多藥耐藥腫瘤細(xì)胞同樣敏感等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)在臨床多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤及惡性實(shí)體腫瘤的治療中取得了可喜的效果,

4、成為目前ACT治療的研究熱點(diǎn)。
　　現(xiàn)在臨床主要通過采集腫瘤患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)行體外誘導(dǎo)收獲CIK用于細(xì)胞過繼治療,但研究表明患者自體CIK細(xì)胞過繼治療對惡性實(shí)體腫瘤的總體有效性僅為30％左右;除患者自體CIK外,健康人來源的同種異體CIK細(xì)胞由于其易于獲得、毒副作用小的特點(diǎn)被用于部分年老體弱患者的治療,然而目前尚無關(guān)于腫瘤患者自體以及健康人CIK

5、細(xì)胞在體外增殖能力、抑瘤活性以及臨床治療效果差異的系統(tǒng)比較。
　　此外,CIK回輸患者體內(nèi)后在體內(nèi)的存活周期也是影響 ACT治療效果的重要因素,但目前尚無關(guān)于此方面的確切文獻(xiàn)報道。本實(shí)驗的研究目的即是通過比較惡性腫瘤患者和健康人來源的CIK細(xì)胞在體外增殖能力、抑瘤活性以及臨床治療效果的差異,并初步分析健康異體CIK細(xì)胞回輸患者體內(nèi)后的存活時間,以期為臨床實(shí)施CIK細(xì)胞過繼治療提供一定的依據(jù)和經(jīng)驗。
　　方法:
　　第一

6、部分:腫瘤患者自體及健康人CIK細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)
　　1. Ficoll密度梯度離心法分離腫瘤患者及健康人 PBMC,在體外經(jīng)干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、抗CD3單克隆抗體(OKT3 monoclonal antibody,OKT3)、重組人白細(xì)胞介素-1(recombinant human interleukin-1,rhIL-1)以及重組人白細(xì)胞介素-2(recombinant human inter

7、leukin-2,rhIL-2)誘導(dǎo)培育CIK細(xì)胞;
　　2.應(yīng)用0.04%臺盼蘭拒染法計數(shù)培育3 d、7 d及14 d時腫瘤患者CIK及健康人CIK細(xì)胞,分析體外增殖能力;
　　3.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測培育3 d、7 d及14 d時腫瘤患者CIK及健康人CIK細(xì)胞中CD3+CD56+表型變化。
　　第二部分:腫瘤患者自體及健康人CIK細(xì)胞體外抑制HCT116和 HepG2并影響其Bcl-2/Bax表達(dá)的初步比較

8、　　1.以人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和肝癌細(xì)胞株HepG2為靶細(xì)胞,設(shè)置效靶比(ratio of effector cells to target cells,E/T)為5:1、10:1、20:1和40:1,分別取培育14 d時腫瘤患者CIK及健康人CIK細(xì)胞處理24 h后通過細(xì)胞增殖、毒性檢測試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)檢測其對靶細(xì)胞的抑制活性,以正常PBMC處理的靶細(xì)胞為對照組;
　　2.以人結(jié)

9、腸癌細(xì)胞株HCT116和肝癌細(xì)胞株HepG2為靶細(xì)胞,設(shè)置效靶比為40:1,分別取培育14 d時腫瘤患者CIK及健康人CIK細(xì)胞處理48h后通過Western Blot檢測靶細(xì)胞中B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)以及Bcl-2相關(guān)X基因(Bcl-2 associated X,Bax)表達(dá)情況并計算Bcl-2/Bax,以正常PBMC處理的靶細(xì)胞為對照組。
　　第三部分:腫瘤患者接受自體或健康人

10、CIK治療后近期療效比較以及健康男性CIK在女性患者體內(nèi)存活周期的初步研究
　　1.取患者接受自體或健康異體 CIK細(xì)胞治療后不同時間點(diǎn)外周血樣本,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞亞群水平,以健康人淋巴細(xì)胞亞群水平為對照;
　　2.以Karnofsky功能狀態(tài)評分(karnofsky performance status,KPS)、數(shù)字疼痛評分法(numerical rating scale,NRS)和體重變化作為主要評估指標(biāo),評

11、估患者接受自體或健康異體CIK細(xì)胞治療后臨床收益反應(yīng)(clinical benefit rate,CBR);
　　3.觀察記錄CIK治療期間毒副反應(yīng),如發(fā)熱、皮疹等不適;
　　4.取8例接受男性親屬CIK細(xì)胞治療女性不同時間點(diǎn)的外周血樣本,提取DNA行常規(guī)PCR,對Y染色體性別決定基因(sex determining region of Y chromosome,Sry)行初步定性分析。
　　結(jié)果:
　　第一部分

12、:腫瘤患者自體及健康人CIK細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)
　　1.臺盼蘭拒染法結(jié)果顯示培育3 d、7 d及14 d時健康人CIK細(xì)胞增殖快于腫瘤患者CIK細(xì)胞;
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測培育3 d、7 d及14 d時CIK細(xì)胞CD3+CD56+表型變化,結(jié)果顯示同時期健康人CIK細(xì)胞中CD3+CD56+比例高于腫瘤患者CIK細(xì)胞。
　　第二部分:腫瘤患者自體及健康人CIK細(xì)胞體外抑制HCT116和 HepG2并影響其Bcl-2/B

13、ax表達(dá)的初步比較
　　1.CCK-8檢測腫瘤患者自體 CIK細(xì)胞、健康人 CIK細(xì)胞以及健康人 PBMC對HCT116和HepG2的抑制能力,結(jié)果顯示這3組細(xì)胞均可不同程度抑制腫瘤細(xì)胞,在同一種效應(yīng)細(xì)胞作用時,效應(yīng)細(xì)胞的抑瘤作用隨效靶比的升高而增加;在同一效靶比下,健康人 CIK細(xì)胞的體外抑瘤活性要強(qiáng)于腫瘤患者自體 CIK細(xì)胞,而正常 PBMC的抑瘤作用相對較弱;
　　2.Western Blot檢測腫瘤患者自體CIK細(xì)胞

14、、健康人CIK細(xì)胞以及健康人PBMC處理后HCT116和HepG2中Bcl-2及Bax表達(dá)情況,結(jié)果顯示這3組細(xì)胞處理后的腫瘤細(xì)胞 Bcl-2、Bax表達(dá)情況均有改變,Bax表達(dá)不同程度上調(diào),Bcl-2表達(dá)不同程度下調(diào),Bcl-2/Bax比值呈現(xiàn)降低趨勢,其中健康人 CIK細(xì)胞引起的這一效應(yīng)最強(qiáng),正常PBMC處理組相對較弱,而腫瘤患者自體CIK處理組介于2者之間。
　　第三部分:腫瘤患者接受自體或健康人 CIK治療后近期療效比較以

15、及健康男性CIK在女性患者體內(nèi)存活周期的初步研究
　　1.流式細(xì)胞術(shù)檢測患者接受 CIK細(xì)胞治療后淋巴細(xì)胞亞群水平,以健康人淋巴細(xì)胞亞群水平為對照,結(jié)果顯示 CIK細(xì)胞過繼治療后24例患者免疫功能均有不同程度改善,其中健康異體CIK細(xì)胞治療組12例患者總CD3+ T、CD4+/CD8+比值改善較自體CIK細(xì)胞治療組更快且持續(xù)時間較長;
　　2.接受自體CIK細(xì)胞或健康異體CIK細(xì)胞治療后60 d的2組患者在KPS評分、NRS

16、評分和體重變化這3個主要評估指標(biāo)以及總體的CBR上無明顯差異;
　　3.觀察期間24例患者均未出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副反應(yīng);
　　4.接受男性親屬CIK治療的8例女性患者在治療后均可檢測到Sry基因條帶,其強(qiáng)弱隨時間逐漸減弱直至消逝,平均持續(xù)時間為(7.0±0.93) w。
　　結(jié)論:
　　本課題初步探討了12例惡性腫瘤患者自體及12例健康人來源的CIK細(xì)胞在體外增殖能力、抑瘤活性及臨床近期療效的差異,并通過對8例接受男性

17、親屬CIK治療的女性患者外周血Sry基因水平行初步定性分析以評估CIK細(xì)胞在患者外周血的存活時間:
　　一、在體外培育過程中,健康人 CIK細(xì)胞較腫瘤患者 CIK細(xì)胞增殖速度快且CD3+CD56+比例較高;
　　二、腫瘤患者自體CIK細(xì)胞、健康人CIK細(xì)胞以及健康人PBMC在體外均可不同程度抑制 HCT116和 HepG2,其中健康人 CIK細(xì)胞抑瘤活性較腫瘤患者自體 CIK細(xì)胞強(qiáng),而健康人PBMC抑瘤活性相對較弱;進(jìn)一步實(shí)

18、驗表明,這3組細(xì)胞均可通過上調(diào)腫瘤細(xì)胞Bax、抑制其Bcl-2表達(dá)水平介導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡,其中健康人CIK細(xì)胞作用最強(qiáng),腫瘤患者自體CIK細(xì)胞次之,健康人PBMC作用相對較弱;
　　三、接受CIK細(xì)胞過繼治療后,24例患者免疫功能均有不同程度改善,其中健康異體CIK細(xì)胞治療組免疫狀況改善較自體CIK細(xì)胞治療組更快且持續(xù)時間較長;2組患者在治療后60 d的KPS評分、NRS評分和體重變化以及總體的CBR上無明顯差異,均未出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副