諾卡氏菌腈水合酶和蠟狀芽孢桿菌酰胺酶的分離純化和酶學(xué)特性研究.pdf

1、腈類(lèi)化合物是自然界中廣泛分布的一類(lèi)物質(zhì),存在于植物、真菌、細(xì)菌、海藻、海綿和昆蟲(chóng)等生物體內(nèi)。在腈轉(zhuǎn)化酶系三種酶的作用下,腈化合物可以通過(guò)兩種途徑轉(zhuǎn)化為羧酸類(lèi)化合物。由于在腈轉(zhuǎn)化過(guò)程中生成的酰胺類(lèi)物質(zhì)和羧酸類(lèi)物質(zhì)在化工和制藥行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景,腈轉(zhuǎn)化酶的生物轉(zhuǎn)化和生物催化過(guò)程越來(lái)越受到重視。
　　 本文綜述了腈轉(zhuǎn)化酶系中腈水合酶和酰胺酶的分離純化技術(shù)以及酶學(xué)性質(zhì)的研究進(jìn)展,研究了諾卡氏菌(Nocardia sp.)108產(chǎn)生的

2、腈水合酶(NHase)和蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)ZJB—07112產(chǎn)生的酰胺酶(amidase)的純化方法與性質(zhì)。
　　 通過(guò)超聲波破碎、硫酸銨沉淀、離子交換層析和疏水作用層析等步驟,得到了電泳純的凝膠電泳均一的諾卡氏菌腈水合酶。該酶的純化倍數(shù)為10.8倍,酶活回收率為24.3％。該酶由兩個(gè)亞基構(gòu)成,一個(gè)為α亞基,分子量為27.0kDa；一個(gè)為β亞基,分子量為32.1 kDa。N端氨基酸序列測(cè)定結(jié)果表明,該

3、酶α亞基的N端氨基酸序列為SEHVNKYTEY,β亞基的N端氨基酸序列為MDGI。對(duì)純化的腈水合酶的酶學(xué)特性研究結(jié)果表明,其最適反應(yīng)pH為7.5,最適反應(yīng)溫度為32℃。該酶表現(xiàn)出的熱穩(wěn)定性并不理想,在40℃時(shí)其半衰期為1.29 h?？疾炝私饘匐x子對(duì)腈水合酶酶活的影響。Ca2+和Co2+能提高該酶的活性,而Zn2+、Ni2+、Fe2+、Cu2+、Mg2+、Al3+和EDTA等能抑制該酶活性。以丙烯腈為底物的酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vmax分別為

4、172.42 mmol/L和344.83μmol/(min·ml)。
　　 通過(guò)超聲波破碎、離子交換層析和疏水作用層析等步驟,得到了電泳純的凝膠電泳均一的蠟狀芽孢桿菌酰胺酶。酰胺酶的純化倍數(shù)為33.3倍,酶活回收率為21.8％,分子量為60.6 kDa。純化后的酰胺酶成熟蛋白N端氨基酸序列為ATIRPDDKAI。在酰胺酶純酶的性質(zhì)研究中,我們發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)pH為7.5,最適反應(yīng)溫度為35℃。當(dāng)環(huán)境溫度從20℃提高到40℃時(shí),該酶