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1、全文分為三部分: 第一部分 大鼠胰腺整體灌注技術(shù)的建立 研究目的:大鼠胰腺整體灌注是離體研究中準(zhǔn)確評(píng)價(jià)胰島β細(xì)胞功能的一種標(biāo)準(zhǔn)方法,具有穩(wěn)態(tài)、定量、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),目前國(guó)內(nèi)尚未建立該項(xiàng)技術(shù)。本研究擬探索開(kāi)展此項(xiàng)研究的技術(shù)方法,為我們下一步的研究工作打下基礎(chǔ)。 研究方法:6周齡健康雄性Wistar大鼠10只,給予高脂飼料(脂肪產(chǎn)能占總熱量的66%)喂養(yǎng)12周后,采用大鼠胰腺移植模型供體手術(shù)操作步驟分離大鼠胰腺組織。
2、分離的大鼠胰腺組織包括胰腺、十二指腸、腹腔干和腸系膜上動(dòng)脈所在的腹主動(dòng)脈段、門(mén)靜脈、腹主動(dòng)脈插管及門(mén)靜脈插管。體外胰腺整體灌注的灌注液采用Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩沖液,基本成分如下:NaCl,118 mM;KCl,4 mM;CaCl<,2>,2.5 mM;MgSO<,4>,1.2mM;KH2P04,1.2 mM;NaHCO<,3>,25 mM;牛血清白蛋白,1.25g/L;右旋糖苷T70,40 g/L。在Krebs-Ringe
3、r碳酸氫鹽緩沖液中分別加入5.6mM:葡萄糖及16.7 mM葡萄糖,在含5.6 mM葡萄糖的Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩沖液中加入19 mM精氨酸,即制成分別含5.6 mM葡萄糖、16.7mM葡萄糖及19 mM精氨酸的Krebs-Ringer緩沖液。調(diào)節(jié)終PH值至7.4。 灌注液由可控制流速的多通道蠕動(dòng)泵泵出,順次通過(guò)腹主動(dòng)脈插管、胰腺組織及門(mén)靜脈插管,在門(mén)靜脈插管出口處收集流出液。體外胰腺整體灌注過(guò)程為:灌注開(kāi)始前1小時(shí)
4、和整個(gè)灌注期間,灌注液和浸浴大鼠胰腺組織的孵育液中持續(xù)輸入含95%O<,2>和5%CO<,2>混合氣體,并保持37℃恒溫;基礎(chǔ)Krebs-Ringer緩沖液灌注20分鐘;繼之依次灌注含5.6 mM葡萄糖灌注液10分鐘、含16.7 mM葡萄糖灌注液20分鐘、含5.6 mM葡萄糖灌注液10分鐘及含19 mM精氨酸灌注液20分鐘;收集每分鐘流出液,貯存于-20℃冰箱,待統(tǒng)一檢測(cè)胰島素水平;灌注期間灌注液流速保持在3ml/min,灌注壓保持在6
5、0-80mmHg,灌注結(jié)束后檢測(cè)十二指腸蠕動(dòng)活性。 研究結(jié)論:本研究成功建立了大鼠胰腺整體灌注技術(shù),可用于大鼠離體胰島β細(xì)胞功能研究。 第二部分 糖脂協(xié)同毒性對(duì)胰島β細(xì)胞胰島素分泌功能影響的活體及離體研究 研究目的:我們的前期研究工作發(fā)現(xiàn),以自發(fā)性酮癥起病的肥胖糖尿病患者以高游離脂肪酸(FFA)血癥及高血糖為突出特征,伴隨嚴(yán)重的外周胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能衰竭。結(jié)合近年來(lái)日益受到關(guān)注的糖脂協(xié)同毒性(glucol
6、ipotoxicity)學(xué)說(shuō),我們推測(cè),此類(lèi)患者體內(nèi)同時(shí)存在的嚴(yán)重高FFA血癥及高血糖可能是其胰島β細(xì)胞功能衰竭的重要原因。本研究通過(guò)外源性升高高脂肥胖大鼠循環(huán)中葡萄糖和FFA水平,觀察高血糖與高FFA血癥協(xié)同作用(糖脂毒性)對(duì)胰島β細(xì)胞功能與酮體生成的影響,探討以自發(fā)性酮癥起病的肥胖糖尿病患者胰島β細(xì)胞功能衰竭的病理生理機(jī)制。 研究方法:將34只高脂肥胖雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組。對(duì)照組(NS組)11只經(jīng)頸靜脈插管輸入生
7、理鹽水;高游離脂肪酸組(FFA組)11只輸入脂肪乳+肝素以維持血FFA水平在1000-2000μmol/L;高糖高游離脂肪酸組(GS-FFA組)12只輸入葡萄糖液及脂肪乳+肝素以維持血FFA及血糖水平分別在1000-2000μmol/L與15-20mmol/L。輸注持續(xù)時(shí)間48小時(shí)。所有3組動(dòng)物于輸液前均經(jīng)頸動(dòng)脈采血測(cè)定血FFA、β-羥丁酸(β-HBA)、血糖、胰島素水平,于輸液結(jié)束時(shí)經(jīng)頸動(dòng)脈采血測(cè)定血FFA、β-HBA及血糖水平。所有
8、3組動(dòng)物于輸液結(jié)束后均隨機(jī)分為A、B2組,每組動(dòng)物5-6只。A組:采用靜脈葡萄糖耐量試驗(yàn)(IVGTT)評(píng)價(jià)胰島β細(xì)胞分泌功能。B組:采用體外胰腺整體灌注技術(shù)評(píng)價(jià)胰島β細(xì)胞分泌功能。 研究結(jié)論:外源性升高高脂肥胖大鼠血糖和血FFA水平可嚴(yán)重?fù)p害高脂肥胖大鼠胰島β細(xì)胞的胰島素分泌功能,導(dǎo)致酮體生成顯著增加,提示以自發(fā)性酮癥起病的胰島β細(xì)胞功能衰竭的病理生理機(jī)制可能與其同時(shí)存在的嚴(yán)重高血糖與高FFA血癥有關(guān)。 第三部分 細(xì)胞凋
9、亡和線粒體凋亡途徑在糖脂毒性導(dǎo)致高脂肥胖大鼠胰島β細(xì)胞功能障礙中的作用 研究目的:糖脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡是T2DM進(jìn)行性胰島β細(xì)胞功能衰退的重要原因,而線粒體凋亡途徑可能在糖脂毒性誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。本研究以胰島β細(xì)胞凋亡和線粒體凋亡途徑為切入點(diǎn),探討糖脂毒性引起高脂肥胖大鼠胰島β細(xì)胞功能障礙的可能機(jī)制。 研究方法:6周齡健康雄性Wistar大鼠18只,給予高脂飼料(脂肪產(chǎn)能占總熱量的66%)喂
10、養(yǎng)12周后,將其隨機(jī)分為3組。對(duì)照組(NS組)6只經(jīng)頸靜脈插管輸入生理鹽水;高游離脂肪酸組(FFA組)6只輸入脂肪乳+肝素以維持血FFA水平在1000-2000p,mol/L;高糖高游離脂肪酸組(GS-FFA組)6只輸入葡萄糖液及脂肪乳+肝素以維持血FFA及血糖水平分別在1000-2000μmol/L與15-20mmol/L。輸注持續(xù)時(shí)間48小時(shí)。所有3組動(dòng)物于輸液前均經(jīng)頸動(dòng)脈采血測(cè)定血FFA、β-羥丁酸(β-HBA)、血糖、胰島素水平
11、,于輸液結(jié)束時(shí)經(jīng)頸動(dòng)脈采血測(cè)定血FFA、β-HBA、血糖水平。輸液結(jié)束后,采用IVGTT評(píng)價(jià)3組動(dòng)物胰島β細(xì)胞分泌功能。IVGTT后處死動(dòng)物,留取胰尾組織,置于10%中性緩沖福爾馬林溶液中固定24小時(shí),石蠟包埋,采用TUNEL技術(shù)檢測(cè)胰島細(xì)胞凋亡水平,采用免疫組織化學(xué)技術(shù)測(cè)定胰島細(xì)胞Cyt C、AIF、caspase-9和caspase-3表達(dá)水平。同時(shí)留取胰尾組織電鏡標(biāo)本以備觀察胰島β細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)變化。 研究結(jié)論:糖脂毒性嚴(yán)
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