綠茶茶多糖與茶多酚對胰島細胞的協(xié)同保護作用研究.pdf

1、近年來,隨著社會發(fā)展和人們生活方式的改變,糖尿病發(fā)病率在全球范圍內呈上升趨勢,嚴重威脅人類健康。目前主要采用降血糖藥物和注射胰島素治療,但會引發(fā)嚴重副作用且不能有效防治并發(fā)癥,所以開發(fā)利用天然的抗糖尿病藥物或保健品顯得尤為必要。研究證實,粗老綠茶能顯著防治糖尿病及其并發(fā)癥,其主要功效成分為茶多酚和茶多糖,但目前粗老茶的開發(fā)力度遠遠不夠,加強對粗老茶資源的高值化開發(fā)利用己成為我國茶葉產業(yè)發(fā)展的必然趨勢。
　　 如今,茶多酚已廣泛應

2、用于醫(yī)藥、化工和食品等行業(yè),而有關茶多糖的研究正處于起步階段。以往報道的多糖制備工藝存在諸多缺點,如有機溶劑消耗量大、污染環(huán)境、多糖活性受到影響等,所以探索安全有效的茶多糖分離純化技術成為亟待解決的問題。此外,針對綠茶防治糖尿病的相關研究僅僅局限于在動物實驗水平上單獨研究茶多酚或茶多糖對糖尿病的治療效果,而細胞實驗水平及二者相互協(xié)同作用的研究鮮有文獻報道。
　　 本文首先探討了粗老綠茶中茶多酚和茶多糖的綜合提取分離工藝;然后利用

3、市售粗茶多糖為原料,將聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、殼聚糖(CTS)樹脂和層析技術等用于茶多糖的分離純化,制備出具有高生理活性的相對純品綠茶多糖(TPS)及其分級組分TPS1、TPS2,并對其進行結構分析;最后采用放射免疫法、DCFH-DA熒光探針、JC-1檢測及單細胞凝膠電泳(SCGE)等方法,觀察TPS和EGCG對鏈脲佐菌素(STZ)損傷MIN6細胞的協(xié)同保護作用,并初步探討可能機制。結果如下:
　　 A.茶葉綜合提取研究中,

4、通過單因素和正交實驗確定茶多酚和茶多糖的最佳熱水浸提條件:料液比1:20、80℃、50 min,兩次,在此基礎上通過有機溶劑綜合萃取法制備粗茶多酚和茶多糖,得率分別為9.75％和5.83％。
　　 B.茶多糖分離純化工藝的研究中,首先確定最佳醇沉多糖條件為:乙醇濃度80％、沉淀3 h、離心10 min,醇沉兩次。進一步采用PVPP處理可達到脫除多糖制品中多酚和蛋白的雙重目的,二者去除率分別達到80.8％和82.7％。最佳條件為:

5、PVPP8.0g/L、溫度30℃、時間30 min、處理兩次:后續(xù)采用CTS樹脂除雜得到TPS,過Q-Scpharose FF分離得到分級組分TPS1和TPS2。
　　 C.采用高效液相色譜、氣相色譜、氨基酸自動分析儀、紫外光譜及紅外光譜等方法對TPS、TPS1和TPS2進行結構分析,發(fā)現(xiàn):(1)三者都是含有蛋白質的酸性多糖糖綴合物。多糖部分主要由半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖組成,含有少量鼠李糖、甘露糖和木糖;而蛋白組分中含有常見的

6、15～16種氨基酸,以天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸最多,肽鏈上含有絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸,而未檢出羥賴氨酸和羥脯氨酸。(2)主要區(qū)別在于:a.TPS的組成多糖分子量分布較廣,而TPS1和TPS2分別為12KDa和10 Kda的相對均一多糖.b.基本組成成分含量不同。TPS、TPS1和TPS2的多糖含量分別為43.25％、82.48％和74.57％,糖醛酸質量分數(shù)分別為23.36％、13.01％和45.75％,蛋白質分別為3.30％、2.59

7、％和5.05％,多酚類均未檢出,TPS2中糖醛酸含量明顯高于TPS1;
　　 D.通過體外細胞實驗研究TPS和EGCG對MIN6細胞的協(xié)同保護作用,表明:(1)TPS-500μg/mL、EGCG-1Oμg/mL和TPS-50+EGCG-1.0μg/mL對受損MIN6細胞分泌胰島素功能的保護干預作用顯著(P＜0.05),TPS-50+EGCG-1.0μg/mL效果最佳(P＜0.01);(2)TPS-50+EGCG-1.0μg/mL

8、組對胰島細胞的保護作用優(yōu)于茶水浸提物,說明茶多糖的分離純化及TPS和EGCG協(xié)同療效的探索有一定的實際應用價值;(3)在葡萄糖刺激胰島素分泌功能、線粒體膜電位(△ψm)、ATP含量、Caspase-3活性及DNA損傷等方面,TPS-50+EGCG-1.0μg/mL對STZ損傷MIN6細胞的保護修復作用都顯著高于二者單獨處理(P＜0.05),充分體現(xiàn)了低劑量TPS和EGCG的協(xié)同療效;(4)TPS+EGCG組對糖尿病的治療作用與保護線粒體

9、功能相關,可能是通過清除ROS,保護DNA和線粒體功能,升高ATP水平等來減輕細胞的氧化應激損傷,抑制凋亡蛋白Caspase-3活性等途徑來實現(xiàn)的;(5)TPS中發(fā)揮保護胰島細胞功能的主要成分是含有富含糖醛酸的酸性多糖TPS2,而非TPS1。
　　 本研究旨在通過一系列安全有效的分離純化工藝制備出具有高天然活性的茶多糖純品,并在此基礎上探討茶多糖和茶多酚對糖尿病的協(xié)同療效及相關機理,為粗老茶葉的綜合利用和新型抗糖尿病保健食品或者