綠茶茶多糖與茶多酚對胰島細(xì)胞的協(xié)同保護(hù)作用研究.pdf

1、近年來,隨著社會發(fā)展和人們生活方式的改變,糖尿病發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢,嚴(yán)重威脅人類健康。目前主要采用降血糖藥物和注射胰島素治療,但會引發(fā)嚴(yán)重副作用且不能有效防治并發(fā)癥,所以開發(fā)利用天然的抗糖尿病藥物或保健品顯得尤為必要。研究證實(shí),粗老綠茶能顯著防治糖尿病及其并發(fā)癥,其主要功效成分為茶多酚和茶多糖,但目前粗老茶的開發(fā)力度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,加強(qiáng)對粗老茶資源的高值化開發(fā)利用己成為我國茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢。
　　 如今,茶多酚已廣泛應(yīng)

2、用于醫(yī)藥、化工和食品等行業(yè),而有關(guān)茶多糖的研究正處于起步階段。以往報道的多糖制備工藝存在諸多缺點(diǎn),如有機(jī)溶劑消耗量大、污染環(huán)境、多糖活性受到影響等,所以探索安全有效的茶多糖分離純化技術(shù)成為亟待解決的問題。此外,針對綠茶防治糖尿病的相關(guān)研究僅僅局限于在動物實(shí)驗(yàn)水平上單獨(dú)研究茶多酚或茶多糖對糖尿病的治療效果,而細(xì)胞實(shí)驗(yàn)水平及二者相互協(xié)同作用的研究鮮有文獻(xiàn)報道。
　　 本文首先探討了粗老綠茶中茶多酚和茶多糖的綜合提取分離工藝;然后利用

3、市售粗茶多糖為原料,將聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、殼聚糖(CTS)樹脂和層析技術(shù)等用于茶多糖的分離純化,制備出具有高生理活性的相對純品綠茶多糖(TPS)及其分級組分TPS1、TPS2,并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析;最后采用放射免疫法、DCFH-DA熒光探針、JC-1檢測及單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)等方法,觀察TPS和EGCG對鏈脲佐菌素(STZ)損傷MIN6細(xì)胞的協(xié)同保護(hù)作用,并初步探討可能機(jī)制。結(jié)果如下:
　　 A.茶葉綜合提取研究中,

4、通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)確定茶多酚和茶多糖的最佳熱水浸提條件:料液比1:20、80℃、50 min,兩次,在此基礎(chǔ)上通過有機(jī)溶劑綜合萃取法制備粗茶多酚和茶多糖,得率分別為9.75％和5.83％。
　　 B.茶多糖分離純化工藝的研究中,首先確定最佳醇沉多糖條件為:乙醇濃度80％、沉淀3 h、離心10 min,醇沉兩次。進(jìn)一步采用PVPP處理可達(dá)到脫除多糖制品中多酚和蛋白的雙重目的,二者去除率分別達(dá)到80.8％和82.7％。最佳條件為:

5、PVPP8.0g/L、溫度30℃、時間30 min、處理兩次:后續(xù)采用CTS樹脂除雜得到TPS,過Q-Scpharose FF分離得到分級組分TPS1和TPS2。
　　 C.采用高效液相色譜、氣相色譜、氨基酸自動分析儀、紫外光譜及紅外光譜等方法對TPS、TPS1和TPS2進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn):(1)三者都是含有蛋白質(zhì)的酸性多糖糖綴合物。多糖部分主要由半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖組成,含有少量鼠李糖、甘露糖和木糖;而蛋白組分中含有常見的

6、15～16種氨基酸,以天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸最多,肽鏈上含有絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸,而未檢出羥賴氨酸和羥脯氨酸。(2)主要區(qū)別在于:a.TPS的組成多糖分子量分布較廣,而TPS1和TPS2分別為12KDa和10 Kda的相對均一多糖.b.基本組成成分含量不同。TPS、TPS1和TPS2的多糖含量分別為43.25％、82.48％和74.57％,糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為23.36％、13.01％和45.75％,蛋白質(zhì)分別為3.30％、2.59

7、％和5.05％,多酚類均未檢出,TPS2中糖醛酸含量明顯高于TPS1;
　　 D.通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究TPS和EGCG對MIN6細(xì)胞的協(xié)同保護(hù)作用,表明:(1)TPS-500μg/mL、EGCG-1Oμg/mL和TPS-50+EGCG-1.0μg/mL對受損MIN6細(xì)胞分泌胰島素功能的保護(hù)干預(yù)作用顯著(P＜0.05),TPS-50+EGCG-1.0μg/mL效果最佳(P＜0.01);(2)TPS-50+EGCG-1.0μg/mL

8、組對胰島細(xì)胞的保護(hù)作用優(yōu)于茶水浸提物,說明茶多糖的分離純化及TPS和EGCG協(xié)同療效的探索有一定的實(shí)際應(yīng)用價值;(3)在葡萄糖刺激胰島素分泌功能、線粒體膜電位(△ψm)、ATP含量、Caspase-3活性及DNA損傷等方面,TPS-50+EGCG-1.0μg/mL對STZ損傷MIN6細(xì)胞的保護(hù)修復(fù)作用都顯著高于二者單獨(dú)處理(P＜0.05),充分體現(xiàn)了低劑量TPS和EGCG的協(xié)同療效;(4)TPS+EGCG組對糖尿病的治療作用與保護(hù)線粒體

9、功能相關(guān),可能是通過清除ROS,保護(hù)DNA和線粒體功能,升高ATP水平等來減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷,抑制凋亡蛋白Caspase-3活性等途徑來實(shí)現(xiàn)的;(5)TPS中發(fā)揮保護(hù)胰島細(xì)胞功能的主要成分是含有富含糖醛酸的酸性多糖TPS2,而非TPS1。
　　 本研究旨在通過一系列安全有效的分離純化工藝制備出具有高天然活性的茶多糖純品,并在此基礎(chǔ)上探討茶多糖和茶多酚對糖尿病的協(xié)同療效及相關(guān)機(jī)理,為粗老茶葉的綜合利用和新型抗糖尿病保健食品或者