轉(zhuǎn)MdSPDS1基因柑橘在低、高溫下抗性表現(xiàn).pdf

1、柑橘是世界上具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水果。生產(chǎn)中容易受到冷害和熱害等環(huán)境脅迫的影響。鑒于柑橘童期長、遺傳上不親和、存在珠心胚干擾等問題,遺傳研究困難,雜交育種在短期內(nèi)難以實(shí)現(xiàn)定向育種目標(biāo)。植物基因工程的發(fā)展為柑橘育種提供了一條新途徑。
　　 本研究以默科特橘橙轉(zhuǎn)MdSPDS1基因的單克隆細(xì)胞系愈傷組織及金柑轉(zhuǎn)基因植株為試材,研究了溫度逆境下轉(zhuǎn)基因材料抗性相關(guān)生理指標(biāo),以評(píng)價(jià)外源基因?qū)μ岣吒涕倏鼓嫘缘淖饔门c應(yīng)用前景。主要研究結(jié)果如下

2、r>　　 1.轉(zhuǎn)基因抗性愈傷單克隆實(shí)驗(yàn)體系建立:卡那霉素抗性默科特橘橙愈傷組織經(jīng)過原生質(zhì)體分離方法獲得單克隆細(xì)胞系,以35S部分區(qū)域?yàn)檎蛞?、MdSPDS1區(qū)域核心序列為反向引物進(jìn)行PCR檢測,篩選、確認(rèn)目的基因已經(jīng)整合至單克隆愈傷基因組中。PCR陽性單克隆細(xì)胞系M3系和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗謩e在4℃、25℃、37℃下處理1周后提取RNA用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行SPDS1基因表達(dá)分析,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因愈傷材料的SPDS1基因的相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)

3、高于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?表明轉(zhuǎn)入的外源基因成功表達(dá)。
　　 2.轉(zhuǎn)基因愈傷單克隆細(xì)胞系抗性評(píng)價(jià)；默科特橘橙愈傷組織單克隆細(xì)胞系和未轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗謩e在4℃、25℃、37℃下處理1周后測定其生長量(鮮重、干重及干鮮重比)、可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD活性、MDA含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn):逆境處理時(shí)轉(zhuǎn)基因愈傷的鮮重生長量高于對(duì)照但是4℃的鮮干重比小于對(duì)照,SOD活性高于對(duì)照,MDA含量小于對(duì)照,可溶性蛋白質(zhì)含量在4℃高于對(duì)照,37℃時(shí)和對(duì)照差別不大。轉(zhuǎn)基因

4、愈傷和對(duì)照提取多胺后經(jīng)過苯甲酰化處理,用高效液相色譜外標(biāo)法定量測定其多胺含量表明:在常溫下和逆境處理時(shí)轉(zhuǎn)基因愈傷的游離亞精胺含量和游離精胺含量所占游離多胺總含量比例高與對(duì)照。轉(zhuǎn)基因愈傷單克隆細(xì)胞系在低溫、高溫逆境下的生理指標(biāo)顯著優(yōu)于對(duì)照。
　　 3.轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定；轉(zhuǎn)基因金柑植株經(jīng)過PCR和southern blot檢測,證明目的基因已經(jīng)插入金柑植株材料中。以實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析SPDS1基因相對(duì)表達(dá)量,表明外源的S

5、PDS1基因在轉(zhuǎn)基因株中獲得表達(dá)。
　　 4.轉(zhuǎn)基因植株的抗性評(píng)價(jià):轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照分別在4℃、25℃、45℃下處理6h后,轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照提取多胺后經(jīng)過苯甲?；幚?用高效液相色譜外標(biāo)法定量測定多胺含量,證實(shí)轉(zhuǎn)基因金柑植株的游離亞精胺含量和游離精胺含量所占游離多胺總含量比例,在常溫和逆境下均高于對(duì)照；直一步測定其可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD活性、MDA含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn):逆境處理時(shí)轉(zhuǎn)基因金柑植株的SOD活性高于對(duì)照,MDA含量小于對(duì)照