比較兔不同動脈間TES基因的表達(dá)及其與動脈粥樣的關(guān)系及可能的機(jī)制.pdf

1、背景：
　　動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是多發(fā)性疾病，是目前人類致死和致殘的主要原因。AS的病理改變以動脈內(nèi)脂質(zhì)沉積，粥樣斑塊形成及伴隨的炎癥反應(yīng)為特征，造成血管部分或完全堵塞進(jìn)而導(dǎo)致心、腦、腎等多器官缺血、梗死，給人類健康造成極大的危害。大量研究已經(jīng)表明不同動脈間發(fā)生動脈粥樣硬化的程度存在差別，其中冠狀動脈較易發(fā)生粥樣硬化，而內(nèi)乳動脈（internal mammary artery，IMA）粥樣硬化發(fā)生率

2、較低。正是這種差別的存在，使得內(nèi)乳動脈成為了冠狀動脈旁路移植術(shù)（coronary artery bypass grafting，CABG）左前降支首選的替代血管。目前已有研究表明：在冠脈搭橋手術(shù)后20年，IMA通暢率仍可大于90％。故此，內(nèi)乳動脈的這種血管特性已成為當(dāng)前研究的熱點。然而，目前這種血管特性的機(jī)制還沒有完全闡明。
　　睪丸相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（testis derived transcript，TES）基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的基因

3、，其定位于人體染色體7q31.2上，編碼一個含421個氨基酸的蛋白質(zhì)（testin）。testin是一種細(xì)胞骨架蛋白，主要分布于黏著斑和細(xì)胞間連接的區(qū)域，可以與一系列細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合。目前研究普遍認(rèn)為TES基因是一種抑癌基因。2012年Archacki等人首次研究了TES基因與動脈粥樣硬化的關(guān)系，他們發(fā)現(xiàn)TES基因在IMA的表達(dá)高于冠狀動脈左前降支（left anterior descending，LAD），并且冠心病患者LAD的TES

4、基因表達(dá)低于非冠心病者。然而，TES基因在AS發(fā)生發(fā)展過程中起到何種作用及其相應(yīng)的分子生物學(xué)機(jī)制目前尚不明確。
　　通過比較內(nèi)乳動脈與冠狀動脈形態(tài)學(xué)及分子學(xué)的差異從而尋找影響動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵因素可能成為揭示動脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制的非常重要的思路和方法，從而為防止動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展提供新的手段。
　　目的：
　　本課題旨在通過比較TES基因在正常兔內(nèi)乳動脈和冠狀動脈間的表達(dá)，以及其在高脂喂養(yǎng)3個月后兔內(nèi)乳

5、動脈和冠狀動脈間的表達(dá)，明確TES基因在內(nèi)乳動脈與冠狀動脈間的血管差異及對高脂的應(yīng)答差異中的作用。同時進(jìn)行原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)，明確兩種來源內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TES的情況。通過在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）過表達(dá)TES基因和下調(diào)TES基因，觀察TES基因?qū)?nèi)皮細(xì)胞功能的影響，闡明TES基因與動脈粥樣硬化的關(guān)系及其可能的機(jī)制，為動脈粥樣硬化的研究提供新的思路和靶點。<

6、br>　　方法：
　　1.應(yīng)用H-E染色法觀察正常家兔內(nèi)乳動脈和冠狀動脈管壁形態(tài)，分別用RT-PCR、Real-Time PCR、Western blotting和免疫組化等方法從mRNA、蛋白及組織三個水平檢測TES基因在內(nèi)乳動脈和冠狀動脈中的表達(dá)情況。同時，用酶消化法分離正常家兔內(nèi)乳動脈和冠狀動脈的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，采用RT-PCR、Real-Time PCR及Western blotting等方法比較這兩種來源不同的

7、內(nèi)皮細(xì)胞TES基因表達(dá)的差別。
　　2.通過高脂飼養(yǎng)兔12周建立動脈粥樣硬化模型，用H-E染色法觀察內(nèi)乳動脈和冠狀動脈管壁形態(tài)，分析評估兩種血管動脈粥樣硬化的發(fā)生情況，同時采用RT-PCR、Real-Time PCR和Western blotting等方法從mRNA及蛋白等水平比較高脂喂養(yǎng)前后內(nèi)乳動脈與冠狀動脈中TES的表達(dá)差異。
　　3.選取HUVECs，通過構(gòu)建過表達(dá)TES的質(zhì)粒和shRNA干擾下調(diào)TES的質(zhì)粒，利用慢病

8、毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建TES基因過表達(dá)和下調(diào)表達(dá)的HUVECs，研究TES基因?qū)?nèi)皮細(xì)胞的生長、增殖、黏附、遷移和調(diào)亡等生物學(xué)行為的影響以及對動脈硬化相關(guān)基因的影響，探討TES影響細(xì)胞功能可能的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.正常家兔內(nèi)乳動脈與冠狀動脈解剖血管走行顯示，內(nèi)乳動脈主干為橫向走行，沿途分叉較少；而冠脈走行于心臟的表面，其分支較多，遠(yuǎn)端走行于心肌內(nèi)，與心肌結(jié)合較為緊密。組織H-E結(jié)果顯示：二者血管壁結(jié)構(gòu)大體可分為三層

9、，分別為內(nèi)膜層、中膜層和外膜層。在結(jié)構(gòu)上比較，內(nèi)乳動脈中膜層含較多彈力纖維，冠脈則以平滑肌細(xì)胞為主，余結(jié)構(gòu)二者無明顯差異。免疫組化結(jié)果表明：TES基因主要表達(dá)在兔內(nèi)乳動脈和冠狀動脈的內(nèi)皮層。RT-PCR、Real-Time PCR和Western blotting結(jié)果顯示：正常家兔內(nèi)乳動脈TES基因的表達(dá)量高于冠脈的表達(dá)量（P<0.05）。TES基因在兔內(nèi)乳來源的內(nèi)皮細(xì)胞及冠脈來源的內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)，且內(nèi)乳來源的內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)量高于冠

10、脈來源的內(nèi)皮細(xì)胞（P<0.05）。
　　2.高脂喂養(yǎng)3月后，與正常組家兔相比，高脂組家兔血脂明顯升高，體重明顯增加，且冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化的比率高于內(nèi)乳動脈（P<0.05）；高脂喂養(yǎng)3月后，家兔內(nèi)乳動脈組織TES基因的表達(dá)量高于冠狀動脈組織（P<0.05）。與正常組相比，高脂喂養(yǎng)組內(nèi)乳動脈組織的TES表達(dá)量升高，冠狀動脈組織TES的表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　3.成功構(gòu)建過表達(dá)TES基因重組質(zhì)粒30

11、5-TES和TES shRNA下調(diào)質(zhì)粒shRNA-TES1/TES2并用慢病毒感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，成功建立TES過表達(dá)及TES下調(diào)的HUVECs。
　?。?）選取過表達(dá)TES的HUVECs和對照組細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞生長曲線的描繪和MTT增殖實驗，結(jié)果顯示：過表達(dá)TES的HUVECs，其生長速度和增殖較對照組沒有明顯變化（P>0.05）。細(xì)胞粘附實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達(dá)TES基因致HUVECs胞黏附能力下降；應(yīng)用人急性單核細(xì)

12、胞白血病細(xì)胞（THP-1）與過表達(dá)TES的HUVECs進(jìn)行共粘附實驗，結(jié)果顯示，其與單核細(xì)胞的共黏附能力亦下降；與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，305-empty組細(xì)胞遷移較對照組增強(qiáng)（P<0.05）。應(yīng)用Hoechst33258染色液對過表達(dá)TES基因的HUVECs的凋亡能力進(jìn)行分析，結(jié)果表明過表達(dá)TES基因不影響細(xì)胞凋亡。應(yīng)用實時定量PCR對過表達(dá)TES基因的HUVEC與對照組細(xì)胞的血小板-內(nèi)皮

13、細(xì)胞粘附分子-1（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1，CD31）、單核細(xì)胞趨化因子（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、P-選擇素（P-selectin）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metallopepti

14、dase-2，MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metallopeptidase-9，MMP-9）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、細(xì)胞核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，

15、TM）、組織因子途徑抑制因子（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）、一氧化氮合酶-3（nitric oxide synthase-3，NOS-3）以及凝集素樣氧化性低密度脂蛋白受體-1（lectin-like oxidized low density lipoprotein recepter-1，LOX-1）的mRNA水平進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，PECAM-1、MMP-9、IL-6、TNF-α、NF-

16、Κb、TM、vWF、TFPI、NOS3、LOX-1較對照組細(xì)胞表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；MCP-1、MMP-2較對照組細(xì)胞表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；ICAM、P-selectin較對照組細(xì)胞表達(dá)水平無差異（P>0.05）。
　?。?）選擇下調(diào)TES的HUVECs和對照組細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞生長曲線的描繪和MTT增殖實驗，結(jié)果顯示：下調(diào)TES表達(dá)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，其生長速度和增殖較對照組沒有明

17、顯變化（P>0.05）。細(xì)胞粘附實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，下調(diào)TES基因表達(dá)致HUVECs黏附能力增加；應(yīng)用單核THP-1細(xì)胞與下調(diào)TES的HUVECs進(jìn)行共粘附實驗，結(jié)果顯示，其與單核細(xì)胞的共黏附能力亦增加；差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，shRNA-control組與shRNA-TES1、shRNA-TES2組在0h時，劃痕距離大體相同。shRNA-TES組細(xì)胞遷移較對照組下降（P<0.05）。應(yīng)用Hoec

18、hst33258染色液對下調(diào)TES基因的HUVECs的凋亡能力進(jìn)行分析，結(jié)果表明下調(diào)TES基因表達(dá)不影響內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。同樣，對下調(diào)TES基因的HUVECs與對照組細(xì)胞進(jìn)行了動脈粥樣硬化相關(guān)基因mRNA水平的檢測。結(jié)果顯示，PECAM-1、MMP-9、IL-6、TNF-α、NF-Κb、TM、vWF、TFPI、NOS3、LOX-1較對照組細(xì)胞表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；MCP-1、MMP-2較對照組細(xì)胞表達(dá)水平升高，差異