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文檔簡介
1、Hepcidin是肝臟特異性表達(dá)的一種小分子抗菌肽,不僅具有廣譜抗菌活性,而且還參與機(jī)體鐵代謝的調(diào)節(jié),是維持鐵穩(wěn)態(tài)關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)節(jié)激素。Hepcidin的表達(dá)紊亂會(huì)引起體內(nèi)鐵超載或鐵缺乏,從而引發(fā)一系列與鐵代謝異常相關(guān)的疾病。Hepcidin調(diào)節(jié)劑的研發(fā)對于鐵代謝障礙性疾病的治療具有重要價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)室前期已通過實(shí)驗(yàn)證實(shí),作為中藥當(dāng)歸中的主要活性成分,當(dāng)歸多糖(ASP)在給藥兩周以后,正常大鼠肝臟中hepcidin的表達(dá)量明顯降低,機(jī)體腸道
2、鐵吸收和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)巨噬細(xì)胞鐵釋放顯著增加,并初步研究了抑制hepcidin表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。為進(jìn)一步探討當(dāng)歸多糖調(diào)節(jié)貧血機(jī)體鐵代謝的作用,本實(shí)驗(yàn)研究了當(dāng)歸多糖對缺鐵性貧血大鼠體內(nèi)hepcidin表達(dá)的抑制作用,并完善了hepcidin抑制的分子機(jī)制;此外,建立了H22荷瘤小鼠模型,在證明當(dāng)歸多糖具有抗腫瘤效果的基礎(chǔ)上,檢測血清中hepcidin及其它鐵調(diào)節(jié)因子的變化,探討當(dāng)歸多糖調(diào)節(jié)鐵代謝與抑瘤作用之間的關(guān)系,為當(dāng)歸多糖體內(nèi)抗腫瘤作用的
3、研究提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ),為研究多糖類藥物抗腫瘤機(jī)制提供新的方向。
第一部分 當(dāng)歸多糖抑制缺鐵性貧血大鼠hepcidin表達(dá)及分子機(jī)制研究
缺鐵性貧血(IDA)大鼠模型采取定期連續(xù)放血再喂以低鐵飼料的方法建立,造模成功后隨機(jī)分為陰性對照組(每天灌胃等體積生理鹽水,連續(xù)給藥16天),當(dāng)歸多糖ASP組(每天按1g/kg灌胃ASP溶液,連續(xù)給藥16天),陽性對照rhEPO組(每天按2000IU/kg腹腔注射rhEPO,連續(xù)給
4、藥3天),造模前后和給藥前后大鼠血清中Tf和hepcidin的濃度變化用ELISA試劑盒檢測,肝組織中hepcidin基因上游調(diào)控蛋白的相對表達(dá)含量用Western blot法檢測,最后用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過長期的自身調(diào)節(jié),造模后IDA大鼠體內(nèi)hepcidin含量比造模前顯著升高21.6%,與此同時(shí)Tf含量也比造模前顯著增加18.0%。給藥后,陽性對照rhEPO組hepcidin含量
5、比給藥前減少28.6%,Tf含量減少19.9%;ASP組hepcidin含量比給藥前減少24.5%,Tf含量減少25.2%。由此推測轉(zhuǎn)鐵蛋白Tf能夠刺激hepcidin水平的增加,可以作為hepcidin表達(dá)的決定因素之一,此研究結(jié)果為進(jìn)一步研究當(dāng)歸多糖抑制hepcidin表達(dá)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)歸多糖可以刺激內(nèi)源性EPO分泌,并下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子JAK1/2,p-JAK1/2,p-SMAD
6、1/5/8和p-ERK1/2的水平,促進(jìn)SMAD7的表達(dá)。此外,SAMD7可以抵消SMAD4介導(dǎo)的作用效果,并削弱BMP-SMAD啟動(dòng)hepcidin的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。p-ERK1/2也可能作用于SMAD1/5/8信號(hào)通路,使p-SMAD1/5/8表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)。最終導(dǎo)致HAMP啟動(dòng)子活性減弱,hepcidin表達(dá)減少。本實(shí)驗(yàn)得出當(dāng)歸多糖抑制hepcidin表達(dá)的部分機(jī)制如下圖所示:
第二部分 當(dāng)歸多糖抑制H22荷瘤小鼠腫瘤生長及調(diào)
7、節(jié)體內(nèi)鐵代謝作用的研究
移植H22鼠肝癌細(xì)胞于小鼠體內(nèi),建立H22荷瘤小鼠模型,造模成功后,分為空白組(不接種不給藥),陰性對照組(每天灌胃等體積生理鹽水,連續(xù)給藥14天),陽性對照組(每天按25mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺,連續(xù)給藥14天),ASP高劑量組(每天按100mg/kg灌胃ASP溶液,連續(xù)給藥14天),ASP中劑量組(每天按50mg/kg灌胃ASP溶液,連續(xù)給藥14天),ASP低劑量組(每天按25mg/kg灌胃ASP
8、溶液,連續(xù)給藥14天),末次給藥后摘眼球取血,處死小鼠后,剝離脾臟、腫瘤并稱重,采用ELISA法測定小鼠血清中hepcidin及其它鐵調(diào)節(jié)因子的含量變化,SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
在H22荷瘤小鼠模型中,當(dāng)歸多糖可以通過刺激脾細(xì)胞的增殖來提高免疫力發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng),與此同時(shí),體內(nèi)鐵代謝也發(fā)生很大改變,hepcidin,IL-6,ferritin,Tf,TfR1和TfR2的含量都顯著增加,經(jīng)當(dāng)歸多糖治療后,均有所恢
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