當(dāng)歸多糖抑制IDA大鼠hepcidin表達(dá)的研究及當(dāng)歸多糖鐵口服液的研制.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室參照已上市的進(jìn)口補(bǔ)鐵制劑多糖鐵復(fù)合物力蜚能(Niferex)，合成了當(dāng)歸多糖鐵復(fù)合物(Angelica sinensis polysaccharide iron complex，APIC)，并經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)APIC對(duì)慢性病貧血(ACD)和缺鐵性貧血(IDA)大鼠貧血狀態(tài)的改善作用較力蜚能好。故我們推測(cè)APIC中的當(dāng)歸多糖(Angelica sinensis polysaccharide，ASP)能夠參與機(jī)體鐵代謝，提高機(jī)體的鐵吸

2、收與鐵利用。因此，本論文第一部分研究ASP抑制hepcidin的表達(dá)作用，IDA大鼠灌胃給予ASP溶液后，測(cè)定大鼠體內(nèi)hepcidin水平的變化，并檢測(cè)大鼠肝臟中hepcidin基因上游調(diào)控分子C/EBPα、SMAD4、STAT3/5以及P-STAT3/5的表達(dá)，探討ASP抑制hepcidin表達(dá)的分子機(jī)制，豐富了APIC的補(bǔ)鐵通路，同時(shí)為進(jìn)一步研究ASP參與機(jī)體鐵代謝的新藥理作用打下基礎(chǔ)；第二部分研究APIC口服液及其藥動(dòng)學(xué)，為臨床治

3、療缺鐵性貧血提供一種新型藥物，并為APIC的臨床給藥方案提供依據(jù)。
　　 第一部分 當(dāng)歸多糖抑制IDA大鼠hepcidin表達(dá)的研究
　　 采用低鐵飼料并輔以定期放血法建立IDA大鼠模型，大鼠造模成功后分為rhEPO組（腹腔注射rhEPO，2000IU·kg-1，qd×3），ASP組（灌胃ASP溶液，1g·kg-1，qd×14），陰性對(duì)照組（灌胃等體積生理鹽水，qd×14），采用ELISA法測(cè)定大鼠血清中hepcidin

4、與EPO的含量，Western blot法檢測(cè)各組肝臟中hepcidin基因上游相關(guān)信號(hào)蛋白的含量，SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
　　 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，ASP可顯著提高IDA大鼠體內(nèi)EPO的表達(dá)水平，并呈現(xiàn)兩個(gè)峰形，給藥后12h達(dá)到第一個(gè)峰值，較rhEPO給藥組晚；類同rhEPO，ASP也可顯著抑制hepcidin的表達(dá)，ASP組在給藥后24h下降到最低值，與給藥前相比，下降率為31.8％，rhEPO組在給藥

5、后12h下降到最低值，與給藥前相比，下降率為13.4％。表明ASP對(duì)IDA大鼠hepcidin的抑制作用比rhEPO更顯著。
　　 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，ASP和rhEPO均可顯著抑制IDA大鼠C/EBPα、P-STAT3/5的表達(dá)，此外，ASP還能夠抑制SMAD4的表達(dá)。而兩組total-STAT3/5的表達(dá)水平較對(duì)照組均無(wú)明顯變化。表明ASP對(duì)hepcidin的抑制作用是通過(guò)下調(diào)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SMAD4的表達(dá)量

6、，并通過(guò)刺激機(jī)體內(nèi)源性EPO的分泌進(jìn)一步下調(diào)C/EBPα及P-STAT3/5的表達(dá)水平得以實(shí)現(xiàn)的。
　　 第二部分 當(dāng)歸多糖鐵口服液的研制
　　 APIC性質(zhì)穩(wěn)定，在水溶液中Ph近中性，不易氧化，水解，對(duì)光不敏感。依據(jù)現(xiàn)代藥劑理論，盡可能使處方單一化。本實(shí)驗(yàn)以口感、外觀、穩(wěn)定性為指標(biāo)，篩選最佳甜味劑、防腐劑和穩(wěn)定劑。結(jié)果表明：加入0.05％的甜菊糖和阿斯巴甜，0.1％山梨酸鉀和0.1％CMC-Na后，口服液澄清，口感最佳

7、，穩(wěn)定性好。
　　 對(duì)本制劑進(jìn)行了質(zhì)量控制和初步穩(wěn)定性研究。按照《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版第一部附錄口服液制劑下的規(guī)定進(jìn)行檢查，結(jié)果表明各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求。采用置換碘量法測(cè)定鐵含量，硫酸-苯酚法測(cè)定多糖含量，結(jié)果顯示置換碘量法加樣回收率為99.63％，RSD為0.64％，硫酸-苯酚法加樣回收率為99.71％，RSD為2.4％，表明這兩種方法快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠；該制劑自然儲(chǔ)存三個(gè)月無(wú)明顯變化，恒溫加速試驗(yàn)三個(gè)月也符合要求，

8、表明本制劑穩(wěn)定性好。
　　 對(duì)本制劑在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程進(jìn)行研究，探討本制劑在正常大鼠體內(nèi)給藥劑量與藥動(dòng)學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系，并比較其在正常大鼠與IDA大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)差異。以低鐵飲食合并定期放血法建立大鼠IDA模型，以火焰原子吸收法測(cè)定血清鐵濃度，DAS 2.0軟件求算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示本制劑在兩種不同生理狀況下大鼠的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程均符合二室模型。正常大鼠 t1/2α，t1/2β，t1/2K

9、a，Tmax，Cmax隨劑量增加無(wú)顯著變化，但CL/F隨劑量增加而增大，AUC(0-7)與劑量不呈線性關(guān)系：當(dāng)劑量為5.83 mg·kg-1 時(shí)，APIC吸收效果最好，當(dāng)劑量大于5.83 mg·kg-1 時(shí)，各劑量組AUC無(wú)顯著性差異。IDA大鼠的血清鐵濃度在給藥4h后均顯著性高于正常大鼠，CL/F、t1/2β與正常組比較均有顯著性差異(p<0.05)。表明本制劑在正常大鼠體內(nèi)不呈線性吸收，其在IDA大鼠與正常大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)存在顯