當(dāng)歸酸性多糖的結(jié)構(gòu)及誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的作用研究.pdf

1、目的：當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，為祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥“補(bǔ)血活血”之要藥，被用作臨床應(yīng)用已有數(shù)千年的歷史。多年來(lái)研究表明：多糖是其主要的藥效物質(zhì)之一，具有促進(jìn)造血、增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗腫瘤等多種作用；能有效地抑制白血病細(xì)胞的增殖，并能誘導(dǎo)其分化，在白血病的治療中發(fā)揮著功補(bǔ)兼施的獨(dú)特療效[1-4]。但多糖結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制復(fù)雜，已成為當(dāng)歸及其復(fù)方藥效基礎(chǔ)研究滯后的瓶頸。近年來(lái)，有學(xué)者報(bào)道當(dāng)

2、歸酸性多糖也有較強(qiáng)的生物活性，但酸性多糖的結(jié)構(gòu)解析較中性多糖更為繁瑣，尚缺乏快速、有效的方法，故其結(jié)構(gòu)鮮有報(bào)道。本課題通過(guò)1）優(yōu)化當(dāng)歸酸性多糖的提取分離工藝，2）建立同時(shí)測(cè)定多糖中中性、酸性和氨基單糖的分析方法，3）對(duì)當(dāng)歸酸性均一性多糖的完整一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，4）比較多種當(dāng)歸酸性均一性多糖抑制白血病細(xì)胞增殖的作用，5）探討活性當(dāng)歸均一性多糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制五方面內(nèi)容，層層深入，以期為解析酸性均一性多糖結(jié)構(gòu)提供新方法，為闡明當(dāng)歸酸性均一

3、性多糖誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡作用的構(gòu)效關(guān)系和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為挖掘潛在的誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的中藥多糖提供試驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：（1）用離子交換色譜法和尺寸排阻色譜法對(duì)當(dāng)歸酸性總多糖進(jìn)行分離純化。用HPSEC、考馬斯亮藍(lán)法、苯酚-硫酸法、咔唑法、UV等分析方法對(duì)當(dāng)歸酸性多糖的均一性及分子量和蛋白質(zhì)、總糖、糖醛酸含量等理化性質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定。（2）采用PMP柱前衍生化法，通過(guò)HPLC色譜條件的優(yōu)化，建立同時(shí)測(cè)定多糖中氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、

4、甘露糖、氨基半乳糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和巖藻糖殘基的方法。（3）采用多糖全水解、甲基化分析、碳化二亞胺糖醛酸還原等化學(xué)方法和IR、HPLC、GC-MS、NMR（1H-，13C-，1H/1H-COSY，HMQC，HMBC和NOESY）等儀器方法對(duì)當(dāng)歸3種主要酸性均一性多糖的完整一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定。（4）CCK-8法測(cè)定6種當(dāng)歸酸性均一性多糖及總糖對(duì)體外培養(yǎng)的白血病K562細(xì)胞增殖的影響。（5）依次用Hochest3

5、3342熒光染色法和流式細(xì)胞術(shù)觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變、檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，用Western blot法檢測(cè)Gal-3和凋亡相關(guān)調(diào)控蛋白Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)。
　　結(jié)果：(1）經(jīng)過(guò)分離純化步驟，得到10種當(dāng)歸酸性多糖，分別命名為AAPS-1Ⅰ、AAPS-1Ⅱ、AAPS-1Ⅲ、AAPS-2Ⅰ、AAPS-2Ⅱ、AAPS-3Ⅰ、AAPS-3Ⅱ、AAPS-4Ⅰ、AAPS-4Ⅱ和AAPS-5，其中AAPS-1Ⅱ、AAPS

6、-2Ⅰ、AAPS-2Ⅱ的含量較高。經(jīng)檢測(cè)AAPS-1Ⅰ、AAPS-1Ⅱ、AAPS-2Ⅰ、AAPS-2Ⅱ、AAPS-3Ⅰ和AAPS-4Ⅰ6種當(dāng)歸酸性多糖為均一性多糖，重均分子量依次為1.7×104、2.3×103、7.2×105、1.0×104、5.9×105和8.1×103Da，理化性質(zhì)有一定差異。（2）建立了PMP柱前衍生化HPLC法測(cè)定多糖中糖醛酸、氨基糖和中性糖的方法，優(yōu)化的色譜條件為Hypersil BDS C18色譜柱(4.6

7、mm i.d.×250mm,5μm)，流動(dòng)相由乙酸銨水溶液（100mM，pH=5.0）、乙腈和四氫呋喃以81﹕17﹕2的體積比組成，流速為1.0mL/min。（3）結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)：AAPS-1Ⅱ由Man、GlcN、Rha、GalN和GlcA以8.3∶1.6∶1.0∶3.1∶2.5的摩爾比組成，單糖連接位點(diǎn)為T-Manp、1,6-Manp、T-Rha、1,4-GalA和1,2-Manp，且摩爾比為1.2∶2.5∶1.4∶1.1∶1.0，進(jìn)一

8、步分析表明AAPS-1Ⅱ的結(jié)構(gòu)中包含[Rha-(1→4)-GalA-(1→2)-Manp-(1→6)-Manp-(1→]n主鏈和Manp-[(1→6)-Manp-(1→]n支鏈；AAPS-2Ⅰ由Man、GlcN、GlcA、GalA、Glc和Gal以1.1∶4.3∶3.5∶1.1∶1.0∶1.1的摩爾比組成，主要包括T-Manp、1,4-Glcp、1,3- GalA、T-Galp和1,2-Manp五種殘基，摩爾比為1.3∶1.0∶1.3∶

9、1.6∶1.9，進(jìn)一步分析表明，AAPS-2Ⅰ的結(jié)構(gòu)中包括[→3)-GalA-(1→2)-Manp-(1→4)-Glcp-(1→2)-Manp-(1→]n、Manp-[(1→2)-Manp-(1→]n和Galp-[(1→4)-Glcp-(1→]n三個(gè)糖鏈；AAPS-2Ⅱ由Man、GlcN、Rha、GalN和Gal以15.3∶5.1∶1.0∶15.3∶1.1的摩爾比組成，主要由T-Glcp、1,4-Rha、1,2-Manp和1,3,6-M

10、anp四種殘基以1.0∶1.8∶2.8∶1.3的摩爾比組成；AAPS-1Ⅰ由Man、Rha、GalN、GlcA、Glc和Ara按照3.0∶2.5∶2.9∶2.9∶1.5∶1.0的摩爾比組成；AAPS-3Ⅰ由Man、GlcN、GalN、GalA、Glc和Gal按照1.0∶3.9∶1.3∶2.1∶1.4∶1.4的摩爾比組成；AAPS-4Ⅰ由Man、GlcN、Rha、GalA和Ara按照1.2∶3.9∶2.9∶1.0∶1.1的摩爾比組成。（4

11、）6種當(dāng)歸酸性均一性多糖對(duì)體外培養(yǎng)的K562細(xì)胞的增殖有不同程度的影響；其中AAPS-1Ⅱ、AAPS-2Ⅰ和AAPS-2Ⅱ可濃度依賴地抑制K562細(xì)胞增殖，AAPS-2Ⅰ的抑制作用最強(qiáng)（IC50為0.056mg/L）。（5）AAPS-2Ⅰ與K562細(xì)胞作用72h后出現(xiàn)了典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)改變；且凋亡誘導(dǎo)作用會(huì)隨藥物濃度的增加而增大；細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9的前體蛋白表達(dá)水平逐漸降低，同時(shí)活化的Caspase-3和Ca

12、spase-9表達(dá)水平逐漸升高。此外，AAPS-2Ⅰ作用于K562細(xì)胞后，隨著其濃度的增加，Gal-3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，提示Gal-3可能是AAPS-2Ⅰ誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的上游作用靶點(diǎn)。
　　結(jié)論：（1）首次建立了同時(shí)測(cè)定多糖中糖醛酸、氨基糖和中性糖組成和含量的HPLC方法，該方法準(zhǔn)確性和精密度均良好。（2）優(yōu)化了從當(dāng)歸中提取酸性多糖的方法，對(duì)當(dāng)歸酸性多糖進(jìn)行了系統(tǒng)分離，得到10種多糖組分，其中6種為酸性均一性多糖；此6種多糖