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文檔簡介
1、目的:
碘是人體內(nèi)一種重要的微量元素,是甲狀腺激素(thyroid hormone,TH)合成的重要原料,并且影響甲狀腺激素合成與分泌的若干中間環(huán)節(jié),甲狀腺功能的正常發(fā)揮直接受膳食中碘含量的調(diào)節(jié)。人類生存環(huán)境中缺碘可造成碘缺乏病,包括地方性甲狀腺腫、克汀病、亞克汀病等。碘缺乏是導致人類智力障礙的重要原因之一。甲狀腺激素是正常生長發(fā)育所必需的激素,具有促進組織分化、生長與發(fā)育成熟的作用,對腦的發(fā)育尤為重要。在碘缺乏病區(qū)普遍存
2、在孕婦孕期碘供應不足的狀況,母體碘的缺乏可直接導致子代腦發(fā)育期甲狀腺激素供應不足,致使子代生長發(fā)育延遲,尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育分化障礙。盡管我國已全面實施補碘多年,基本控制了地方性甲狀腺腫及克汀病,但在原碘缺乏病區(qū)仍有大量碘缺乏導致的亞克汀病患兒存在,碘缺乏對兒童智力和體格廣泛及嚴重的危害性已成為嚴重影響人口素質(zhì),阻礙發(fā)展的重大公共衛(wèi)生問題。在生長發(fā)育過程中,海馬組織終生存在神經(jīng)可塑性現(xiàn)象;海馬神經(jīng)發(fā)育的改變,伴隨著海馬相關(guān)功能的改變
3、。甲狀腺功能減退能損害神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能,而且碘缺乏能夠引起子代中樞神經(jīng)系統(tǒng)不可逆的損傷,這些機制都不是很明確。Caveolin-1,Synaptophysin,Doublecortin及Neural cell adhesion molecule(NCAM)在生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用:Caveolin-1在細胞遷移中調(diào)節(jié)細胞膜的成分和細胞表面的擴張,參與信號分子的極化和細胞骨架的重構(gòu);Synaptophysin是腦發(fā)育過程中常用的
4、反應突觸狀態(tài)的指標,它一直被作為軸突終末特異性標志物,用以檢測突觸的密度和分布;Doublecortin通過調(diào)節(jié)新生神經(jīng)元微管的細胞骨架結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性,促進未成熟神經(jīng)元的遷移和分化;NCAM通過親同性及親異性結(jié)合,調(diào)節(jié)細胞軸突生長、遷移及目標識別。
碘缺乏和甲狀腺功能減退影響大鼠仔鼠海馬發(fā)育過程中是否涉及到Caveolin-1,Synaptophysin,Doublecortin及NCAM-180的改變,CA1區(qū)、CA3區(qū)和
5、DG區(qū)這幾種蛋白的變化規(guī)律如何,各區(qū)的變化是否不同,目前尚不清楚。據(jù)此,我們采用碘缺乏飼料和不同劑量的丙基硫尿嘧啶(Propylthiouracil,PTU)飲水建立碘缺乏和甲狀腺功能減退動物模型,觀察低甲狀腺素狀態(tài)下海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)的受損狀況,應用Western Blotting技術(shù)檢測不同發(fā)育階段仔鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)Caveolin-1,Synaptophysin,Doublecortin及NCAM-18
6、0的變化規(guī)律,探討碘缺乏和甲狀腺功能減退導致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育損害的機制,為碘缺乏性智力低下性疾病的預防提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
實驗方法
1、實驗動物與分組
健康2月齡雌性Wistar大鼠,體重250 g-280 g。取孕鼠28只,按體重均衡原則隨機分為4組,每組7只孕鼠,分組及飲食為:碘缺乏組,缺碘飼料+自來水;5 ppm PTU組,普通飼料+5 ppm PTU+自來水;15 ppm PTU組,普
7、通飼料+15 ppm PTU+自來水;對照組,普通飼料+自來水。自妊娠第6天(Gestational day 6,GD6)起,按照上述方式喂養(yǎng),直至仔鼠出生后第28天(Postnatal day 28,PN28);此后至PN42,各組均飼以普通飼料,飲用自來水。PN4時,每窩按雌雄數(shù)量盡可能相等的原則保留9-10只仔鼠。PN25時斷乳、分籠飼養(yǎng)。PN14、PN21、PN28和PN42時,每組隨機從不同窩中各抽取8只仔鼠,其中5只仔鼠灌流
8、固定大腦,用于大腦組織病理切片和形態(tài)學觀察;另3只仔鼠剝離大腦組織,用于Western Blotting測定。
2、仔鼠體重及血清TSH、TH測定
分別于PN14、PN21、PN28和PN42時稱取仔鼠體重。在PN14、PN21、PN28和PN42時,每組分別隨機選取8只仔鼠,開胸采血,3000 rpm離心5 min,取上清。采用固相化學免疫發(fā)光法測定血清中游離四碘甲狀腺原氨酸(FT4)、游離三碘甲狀腺原氨酸
9、(FT3)和促甲狀腺激素(TSH)的含量。
3、海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)存活神經(jīng)元觀察
各組于PN14、PN21、PN28和PN42分別取5只大鼠,采血后,固定大腦,常規(guī)石蠟包埋,行冠狀位連續(xù)切片(61μm),當觀察到切片包含完整的海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)時,每隔5~6張連續(xù)切片收集1張,制成石蠟切片。每只仔鼠隨機選取3張切片,行尼氏染色(Nissl Staining),鏡下觀察CA1區(qū)、CA3區(qū)
10、和DG區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu),計數(shù)每個視野下存活神經(jīng)元數(shù),取其平均值。
4、海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)神經(jīng)纖維觀察
各組于PN14、PN21、PN28和PN42分別取5只大鼠,采血后,固定大腦,常規(guī)石蠟包埋,行冠狀位連續(xù)切片(6μm),當觀察到切片包含完整的海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)時,每隔5~6張連續(xù)切片收集1張,制成石蠟切片。每只仔鼠隨機選取3張切片,行鍍銀染色(Silver Staining),鏡下觀
11、察CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)神經(jīng)纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律。
5、海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)相關(guān)蛋白檢測分析
在PN14、PN21、PN28和PN42時,每組分別從不同窩中隨機選取3只仔鼠,取大腦組織,剝離海馬,按其組織學結(jié)構(gòu)切分為CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)。采用Western Blotting技術(shù)分別檢測各區(qū)Caveolin-1,Synaptophysin,Doublecortin及NCAM-180的表達
12、。
6、統(tǒng)計學處理
采用SPSS12.0建立數(shù)據(jù)庫,進行統(tǒng)計分析。結(jié)果表示為Mean±SD。Caveolin-1,Synaptophysin,Doublecortin及NCAM-180表達的主效應分析采用3×4×4析因設計方差分析;在PN14、PN21、PN28和PN42時,各組仔鼠體重,CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)存活細胞數(shù),Caveolin-1,Synaptophysin,Doublecorfin及NCAM
13、-180表達的比較均采用單因素方差分析(ANOVA)。滿足方差齊性時,兩兩比較采用最小顯著差值法(Least-significant Difference,LSD):不滿足方差齊性時,兩兩比較采用Dunnett’s T3法。P<0.05時差異有統(tǒng)計學意義,方差齊性檢驗水準定為0.1。
結(jié) 論
1、用碘缺乏飼料和不同劑量PTU飲水建立甲狀腺功能減退大鼠仔鼠動物模型,發(fā)現(xiàn)仔鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)存活神經(jīng)
14、細胞數(shù)減少,神經(jīng)纖維受損。
2、碘缺乏和甲狀腺功能減退可導致Caveolin-1和NCAM-180表達增多,Doublecortin和Synaptophysin表達下降。
3、即使PN42時TH和TSH水平基本恢復,但神經(jīng)元損傷及蛋白水平的異常改變?nèi)匀淮嬖?。推測碘缺乏和甲狀腺功能減退損傷仔鼠海馬神經(jīng)發(fā)育的機制可能是由于其上調(diào)海馬區(qū)Caveolin-1和NCAM-180的蛋白水平及下調(diào)Doublecortin和
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