碘缺乏及甲狀腺功能減退對(duì)大鼠仔鼠海馬神經(jīng)發(fā)育的影響及Caveolin-1和Doublecortin等相關(guān)蛋白表達(dá)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　 碘是人體內(nèi)一種重要的微量元素,是甲狀腺激素(thyroid hormone,TH)合成的重要原料,并且影響甲狀腺激素合成與分泌的若干中間環(huán)節(jié),甲狀腺功能的正常發(fā)揮直接受膳食中碘含量的調(diào)節(jié)。人類生存環(huán)境中缺碘可造成碘缺乏病,包括地方性甲狀腺腫、克汀病、亞克汀病等。碘缺乏是導(dǎo)致人類智力障礙的重要原因之一。甲狀腺激素是正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的激素,具有促進(jìn)組織分化、生長(zhǎng)與發(fā)育成熟的作用,對(duì)腦的發(fā)育尤為重要。在碘缺乏病區(qū)普遍存

2、在孕婦孕期碘供應(yīng)不足的狀況,母體碘的缺乏可直接導(dǎo)致子代腦發(fā)育期甲狀腺激素供應(yīng)不足,致使子代生長(zhǎng)發(fā)育延遲,尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育分化障礙。盡管我國(guó)已全面實(shí)施補(bǔ)碘多年,基本控制了地方性甲狀腺腫及克汀病,但在原碘缺乏病區(qū)仍有大量碘缺乏導(dǎo)致的亞克汀病患兒存在,碘缺乏對(duì)兒童智力和體格廣泛及嚴(yán)重的危害性已成為嚴(yán)重影響人口素質(zhì),阻礙發(fā)展的重大公共衛(wèi)生問題。在生長(zhǎng)發(fā)育過程中,海馬組織終生存在神經(jīng)可塑性現(xiàn)象；海馬神經(jīng)發(fā)育的改變,伴隨著海馬相關(guān)功能的改變

3、。甲狀腺功能減退能損害神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能,而且碘缺乏能夠引起子代中樞神經(jīng)系統(tǒng)不可逆的損傷,這些機(jī)制都不是很明確。Caveolin-1,Synaptophysin,Doublecortin及Neural cell adhesion molecule(NCAM)在生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用:Caveolin-1在細(xì)胞遷移中調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的成分和細(xì)胞表面的擴(kuò)張,參與信號(hào)分子的極化和細(xì)胞骨架的重構(gòu)；Synaptophysin是腦發(fā)育過程中常用的

4、反應(yīng)突觸狀態(tài)的指標(biāo),它一直被作為軸突終末特異性標(biāo)志物,用以檢測(cè)突觸的密度和分布；Doublecortin通過調(diào)節(jié)新生神經(jīng)元微管的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性,促進(jìn)未成熟神經(jīng)元的遷移和分化；NCAM通過親同性及親異性結(jié)合,調(diào)節(jié)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)、遷移及目標(biāo)識(shí)別。
　　 碘缺乏和甲狀腺功能減退影響大鼠仔鼠海馬發(fā)育過程中是否涉及到Caveolin-1,Synaptophysin,Doublecortin及NCAM-180的改變,CA1區(qū)、CA3區(qū)和

5、DG區(qū)這幾種蛋白的變化規(guī)律如何,各區(qū)的變化是否不同,目前尚不清楚。據(jù)此,我們采用碘缺乏飼料和不同劑量的丙基硫尿嘧啶(Propylthiouracil,PTU)飲水建立碘缺乏和甲狀腺功能減退動(dòng)物模型,觀察低甲狀腺素狀態(tài)下海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)的受損狀況,應(yīng)用Western Blotting技術(shù)檢測(cè)不同發(fā)育階段仔鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)Caveolin-1,Synaptophysin,Doublecortin及NCAM-18

6、0的變化規(guī)律,探討碘缺乏和甲狀腺功能減退導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育損害的機(jī)制,為碘缺乏性智力低下性疾病的預(yù)防提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組
　　 健康2月齡雌性Wistar大鼠,體重250 g-280 g。取孕鼠28只,按體重均衡原則隨機(jī)分為4組,每組7只孕鼠,分組及飲食為:碘缺乏組,缺碘飼料+自來水；5 ppm PTU組,普通飼料+5 ppm PTU+自來水；15 ppm PTU組,普

7、通飼料+15 ppm PTU+自來水；對(duì)照組,普通飼料+自來水。自妊娠第6天(Gestational day 6,GD6)起,按照上述方式喂養(yǎng),直至仔鼠出生后第28天(Postnatal day 28,PN28)；此后至PN42,各組均飼以普通飼料,飲用自來水。PN4時(shí),每窩按雌雄數(shù)量盡可能相等的原則保留9-10只仔鼠。PN25時(shí)斷乳、分籠飼養(yǎng)。PN14、PN21、PN28和PN42時(shí),每組隨機(jī)從不同窩中各抽取8只仔鼠,其中5只仔鼠灌流

8、固定大腦,用于大腦組織病理切片和形態(tài)學(xué)觀察；另3只仔鼠剝離大腦組織,用于Western Blotting測(cè)定。
　　 2、仔鼠體重及血清TSH、TH測(cè)定
　　 分別于PN14、PN21、PN28和PN42時(shí)稱取仔鼠體重。在PN14、PN21、PN28和PN42時(shí),每組分別隨機(jī)選取8只仔鼠,開胸采血,3000 rpm離心5 min,取上清。采用固相化學(xué)免疫發(fā)光法測(cè)定血清中游離四碘甲狀腺原氨酸(FT4)、游離三碘甲狀腺原氨酸

9、(FT3)和促甲狀腺激素(TSH)的含量。
　　 3、海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)存活神經(jīng)元觀察
　　 各組于PN14、PN21、PN28和PN42分別取5只大鼠,采血后,固定大腦,常規(guī)石蠟包埋,行冠狀位連續(xù)切片(61μm),當(dāng)觀察到切片包含完整的海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)時(shí),每隔5～6張連續(xù)切片收集1張,制成石蠟切片。每只仔鼠隨機(jī)選取3張切片,行尼氏染色(Nissl Staining),鏡下觀察CA1區(qū)、CA3區(qū)

10、和DG區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu),計(jì)數(shù)每個(gè)視野下存活神經(jīng)元數(shù),取其平均值。
　　 4、海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)神經(jīng)纖維觀察
　　 各組于PN14、PN21、PN28和PN42分別取5只大鼠,采血后,固定大腦,常規(guī)石蠟包埋,行冠狀位連續(xù)切片(6μm),當(dāng)觀察到切片包含完整的海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)時(shí),每隔5～6張連續(xù)切片收集1張,制成石蠟切片。每只仔鼠隨機(jī)選取3張切片,行鍍銀染色(Silver Staining),鏡下觀

11、察CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)神經(jīng)纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律。
　　 5、海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)相關(guān)蛋白檢測(cè)分析
　　 在PN14、PN21、PN28和PN42時(shí),每組分別從不同窩中隨機(jī)選取3只仔鼠,取大腦組織,剝離海馬,按其組織學(xué)結(jié)構(gòu)切分為CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)。采用Western Blotting技術(shù)分別檢測(cè)各區(qū)Caveolin-1,Synaptophysin,Doublecortin及NCAM-180的表達(dá)

12、。
　　 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用SPSS12.0建立數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表示為Mean±SD。Caveolin-1,Synaptophysin,Doublecortin及NCAM-180表達(dá)的主效應(yīng)分析采用3×4×4析因設(shè)計(jì)方差分析；在PN14、PN21、PN28和PN42時(shí),各組仔鼠體重,CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)存活細(xì)胞數(shù),Caveolin-1,Synaptophysin,Doublecorfin及NCAM

13、-180表達(dá)的比較均采用單因素方差分析(ANOVA)。滿足方差齊性時(shí),兩兩比較采用最小顯著差值法(Least-significant Difference,LSD):不滿足方差齊性時(shí),兩兩比較采用Dunnett’s T3法。P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,方差齊性檢驗(yàn)水準(zhǔn)定為0.1。
　　 結(jié) 論
　　 1、用碘缺乏飼料和不同劑量PTU飲水建立甲狀腺功能減退大鼠仔鼠動(dòng)物模型,發(fā)現(xiàn)仔鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)存活神經(jīng)

14、細(xì)胞數(shù)減少,神經(jīng)纖維受損。
　　 2、碘缺乏和甲狀腺功能減退可導(dǎo)致Caveolin-1和NCAM-180表達(dá)增多,Doublecortin和Synaptophysin表達(dá)下降。
　　 3、即使PN42時(shí)TH和TSH水平基本恢復(fù),但神經(jīng)元損傷及蛋白水平的異常改變?nèi)匀淮嬖?。推測(cè)碘缺乏和甲狀腺功能減退損傷仔鼠海馬神經(jīng)發(fā)育的機(jī)制可能是由于其上調(diào)海馬區(qū)Caveolin-1和NCAM-180的蛋白水平及下調(diào)Doublecortin和