紅樹林植物海芒果來源的抗腫瘤活性物質的篩選和作用機制的研究.pdf

1、肝癌和白血病都是世界上最普遍的惡性腫瘤之一,雖然現(xiàn)在針對這兩種疾病臨床上采取了手術、非手術方式的藥物治療及手術與藥物治療相結合的療法,但對這兩種疾病的治療效果并不完全令人滿意。另外,手術治療受腫瘤的大小、位置、腫瘤轉移等因素的影響,并不是在任何時候都能實施。雖然有些西藥也用于治療這兩種疾病,但長期服用會有較大的毒副作用,因而從天然活性物質中尋找并開發(fā)有效低毒的治療藥物變得非常迫切。本課題的目的就是：從紅樹林植物海芒果(Cerbera m

2、anghas L.)來源的化合物中篩選抗腫瘤活性物質并進一步研究其可能的作用機理。 方法：利用MTT法研究從海芒果中提取的化合物對人肝癌細胞HepG2、人正常肝細胞張氏肝(Chang Liver)和人白血病細胞HL-60增殖的影響；利用吖啶橙(AO)/溴化乙錠(EB)雙染的方法從形態(tài)學上觀察化合物對細胞凋亡作用的影響；利用碘化丙啶(PI)單染、Annexin V-FITC和PI雙染后流式細胞儀分析,及DNA片斷化分析法(DNA f

3、ragment assay)進一步證實化合物是否誘導腫瘤細胞的凋亡作用；利用熒光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)觀察化合物作用細胞后,對與細胞周期與凋亡相關基因表達的影響；利用Caspase檢測試劑盒檢測化合物作用細胞后對細胞Caspase-3,-8,-9酶活力的影響；運用western blot的方法觀察GHSC-79作用后Fas、FasL蛋白表達水平的變化。結果表明,海芒果果實提取的化合物GHSC-71-GHSC

4、-81對HepG2和HL-60細胞均有一定程度的抑制作用,其中HepG2細胞對化合物GHSC-75最敏感,HL-60細胞對化合物GHSC-79最敏感,兩種化合物在25μg/ml的濃度下對細胞的抑制率都達到了98％；進一步在化合物GHSC-75對HepG2細胞增殖影響的研究中發(fā)現(xiàn),GHSC-75對HepG2細胞的抑制作用呈現(xiàn)濃度和時間依賴性,在作用HepG2細胞12 h,24 h,48h和72 h后,IC50分別為：192.61±0.19

5、,26.28±0.25,5.79±0.31,1.85±0.13μM,但對人正常肝細胞Chang Liver顯示出較低的毒性。流式細胞分析顯示,化合物GHSC-75作用HepG2細胞后,細胞的凋亡作用并不明顯,而HepG2細胞的細胞周期被阻滯在S期和G2/M期。Real-time RT-PCR結果表明,隨著化合物GHSC-75作用濃度的遞增,周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21的基因表達相應增加,而與細胞周期S期到G2期過渡相關的周期蛋白激酶C

6、DK2基因表達呈下降趨勢；我們又在化合物GHSC-79對HL-60細胞影響的研究中發(fā)現(xiàn),GHSC-79對HL-60細胞抑制作用也呈濃度和時間依賴性,當濃度低于0.11μM時GHSC-79對HL-60細胞沒有明顯的抑制作用,作用12h,24 h,48 h后,IC50分別為：9.73±0.23,3.40±0.14,2.15±0.16μM。AO/EB染色后,熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細胞核有明顯的核鄒縮,出現(xiàn)凋亡小體等凋亡細胞形態(tài)。DNA含量和細胞周期

7、分析結果顯示,在0,1.15,2.87,5.73,8.60,和11.47μM的GHSC-79作用24 h后,凋亡細胞率升高呈濃度依賴性,分別為1.74％,1.92％,6.70％,12.38％,17.25％,20.55％,同時細胞被阻滯在G2/M和S期。Annexin V-FITC/PI雙染后流式細胞儀分析結果,早期凋亡細胞率呈現(xiàn)濃度和時間依賴性,在0,1.15,2.87,5.73,8.60,和11.47μM GHSC-79作用24 h后

8、早期凋亡細胞率分別為0.27％,7.52％,12.45％,17.34％,20.49％,21.57％。5.73μM的GHSC-79處理細胞12 h后與對照(0.89％)相比,處理組的早期凋亡細胞數(shù)明顯升高(9％);處理24 h后與對照(0.73％)相比,處理組的早期凋亡細胞數(shù)繼續(xù)上升(14.67％)。DNA片斷化分析結果顯示,與對照相比,GHSC-79處理組作用細胞48 h后出現(xiàn)明顯的梯形條帶,充分證實化合物GHSC-79具有誘導HL-6

9、0細胞凋亡的作用。在Caspase-3,-8,-9酶活力檢測中,當5.73μM GHSC-79處理HL-60細胞后Caspase-3的活性升高比較明顯,在處理3 h,6 h,12 h和24 h后Caspase-3酶活性分別為對照組的3.81倍(P<0.05),5.88倍(P<0.05),18.75倍(P<0.01),30.7倍(P<0.01)。Caspase-8,Caspase-9酶的活性在5.73μMGHSC-79處理15 min后就

10、開始升高,分別為對照的1.7倍(P<0.01)和1.36倍(P<0.05)。雖然Caspase-8,Caspase-9酶的活性隨著處理時間的增加有所波動,但與對照相比,Caspase-8,Caspase-9酶的活性總體都呈上升趨勢。實驗中我們又發(fā)現(xiàn)GHSC-79處理后,能使死亡配體FasL的基因和蛋白水平相應增加。 結論：本課題中,我們從紅樹林植物海芒果果實中提取的一系列皂苷類化合物(GHSC-71-GHSC-81)對肝癌細胞H

11、epG2和白血病細胞HL-60均有一定程度的抑制作用。其中GHSC-75對HepG2細胞的抑制作用最強；GHSC-79對HL-60細胞的抑制作用最強；從GHSC-75對HepG2細胞增殖抑制的研究中發(fā)現(xiàn):GHSC-75通過細胞周期S期和G2/M期的阻滯,能明顯抑制肝癌細胞HepG2細胞的增殖,并且伴隨著細胞周期蛋白激酶抑制劑p21基因表達的上調和S/G2期周期過渡相關的激酶Cdk2基因表達的下降。同時GHSC-75對正常肝細胞Chang