海藻糖合酶特性及固定化條件的研究.pdf

1、海藻糖是一種安全的天然糖類(lèi)，具有非還原性，保濕性，熱酸穩(wěn)定性，抗凍結(jié)、干燥性等特性，而且它對(duì)生物大分子和生物體組織有著非特異性的保護(hù)作用。海藻糖在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)、化妝品工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，但是海藻糖制取上的困難限制了它的廣泛應(yīng)用。本研究立足于利用海藻糖合酶酶法合成海藻糖，研究?jī)?nèi)容包括海藻糖合酶高產(chǎn)菌株惡臭假單胞菌P06的誘變選育，海藻糖合酶的分離純化、酶學(xué)特性及酶的固定化條件的研究。 本課題以惡臭假單

2、胞菌（本研究室保藏菌種Pseudomonas putida P06，簡(jiǎn)稱(chēng)P06）為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)紫外線與亞硝基胍復(fù)合誘變最終選育出一株海藻糖合酶高產(chǎn)突變株P(guān)06-3-5。與出發(fā)菌株相比，其產(chǎn)酶能力提高了1.25倍。突變株P(guān)06-3-5經(jīng)10余代傳代實(shí)驗(yàn)，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。 海藻糖合酶屬于胞內(nèi)酶，自P06-3-5菌株破壁而得，粗酶經(jīng)過(guò)Sephadex-G75和Sephadex-G200凝膠過(guò)濾柱后，通過(guò)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證

3、其純度，得到兩條亞基帶，并測(cè)定它們分子量分別為55000Da和50000Da，并對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行了研究。 本研究首先對(duì)四種固定化載體的固定化效果進(jìn)行考察，并對(duì)酶活和穩(wěn)定性較好的固定化酶的固定化條件進(jìn)行優(yōu)化。確定戊二醛濃度為0.5％、液態(tài)酶與殼聚糖凝膠的配比為1：1、交聯(lián)pH值為8.0、交聯(lián)溫度為15℃、交聯(lián)時(shí)間為12h條件下，固定化海藻糖合酶的活性最高。 本研究還以細(xì)菌纖維素為載體，采用吸附-交聯(lián)的方法將海藻糖合酶固定化

4、，在最適固定化條件下，15℃吸附20h，然后與6％戊二醛在15℃交聯(lián)20h。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與游離酶相比，固定化酶的最適pH值向堿性方向移動(dòng)0.4，為pH7.4，最適作用溫度為45℃，比游離海藻糖合酶提高5℃，酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性均有較大提高；重復(fù)使用6次后，酶剩余活力保持在86％左右，有較好的操作穩(wěn)定性和重復(fù)使用穩(wěn)定性。 在細(xì)菌纖維素固定海藻糖合酶的條件下，本文對(duì)麥芽糖濃度、反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)溫度等因素對(duì)麥芽糖轉(zhuǎn)化率的影響進(jìn)行了研究。結(jié)