芍芪多苷抗肝纖維化作用及其主要成分芍藥苷抑制肝星狀細胞增殖的分子機制.pdf

1、肝纖維化是慢性肝病重要的病理特征，也是肝硬化發(fā)生的前奏和必經(jīng)的中間環(huán)節(jié)，是臨床治療慢性肝病的關鍵環(huán)節(jié)。近年來國內(nèi)外取得廣泛共識的是：肝星狀細胞(HSC)是肝臟ECM的主要來源，是肝纖維化形成的細胞學基礎，它在ECM代謝和各種細胞介質(zhì)的產(chǎn)生過程中處于中心地位，HSC的表型激活和過度增殖是肝纖維化形成過程的關鍵?？垢卫w維化的治療，國內(nèi)外雖有過報道，但尚未找到理想的藥物。 芍芪多苷(SQDG)是采用科學的浸提和純化技術，由白芍和黃芪混

2、合提取制成的質(zhì)量可控的天然藥物的有效部位，主要含芍藥苷、黃芪甲苷等成分。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SQDG對四氯化碳誘導的化學性肝損傷和卡介苗加脂多糖誘導的免疫性肝損傷具有保護作用，且效果優(yōu)于白芍、黃芪分別單獨提取后再混合制劑(白芍總苷+黃芪總皂苷)及單獨使用白芍總苷或黃芪總皂苷。 本實驗采用豬血清誘導的免疫性肝纖維化模型，首先從整體水平考察了SQDG對大鼠免疫性肝纖維化的作用；體外選用HSC-T6細胞株，從細胞和分子水平進一步探討

3、SQDG中有效活性成分芍藥菅(Pae)抑制HSC增殖的分子機制，觀察Pae對重組大鼠血小板衍生生長因子-BB(rrPDGF-BB)刺激HSC-T6增殖的影響；探討G蛋白偶聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導通路與ERK1/2信號通路在rrPDGF-BB刺激HSC-T6增殖中的作用及相互關系，尋找其抑制HSC增殖的作用靶點。 目的：采用豬血清誘導的免疫性肝纖維化模型，從病理形態(tài)學、轉(zhuǎn)氨酶、血清纖維化標志物、脂質(zhì)過氧化等方面，明確SQDG對大鼠免疫性肝纖維

4、化的治療作用；以肝纖維化過程中的關鍵細胞-HSC為突破口，觀察SQDG中主要有效成分Pae對rrPDGF-BB刺激HSC-T6增殖的影響以及環(huán)氧合酶-2(COX-2)在HSC-T6增殖中的作用；探討G蛋白偶聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導通路與ERK1/2信號通路在rrPDGF-BB刺激HSC-T6增殖中的作用，探討Pae對rrPDGF-BB刺激的HSC-T6 G蛋白的表達及ERK1/2通路活化的影響，并進一步研究兩條信號通路之間的相互關系，部分闡明Pae

5、抑制HSC增殖的分子機制。 方法：大鼠腹腔注射豬血清建立免疫性肝纖維化模型，設立正常對照組、模型組、SQDG給藥組(42.5，85，170mg·kg-1)和陽性對照秋水仙堿組(Col 0.1 mg·kg-1)。HE染色和Masson染色對肝臟組織作病理檢查。分光光度法檢測血清中轉(zhuǎn)氨酶活性和肝勻漿中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、羥脯氨酸(Hyp)含量；放免法檢測血清中透明質(zhì)

6、酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)和層粘蛋白(LN)、前列腺素E2(PGE2)水平；MTT法檢測HSC增殖情況；放射性免疫法測定HSC-T6 cAMP水平；采用Western blot技術檢測HSC-T6中COX-2、Gas、Gai-1、Gai-2、Gai-3蛋白表達和ERK1/2磷酸化水平的變化。 結果： 1.SQDG對豬血清誘導的免疫性肝纖維化大鼠的保護作用SQDGX寸豬血清誘導的免疫性肝纖維化大鼠具

7、有明顯的保護作用。 提示：SQDG可以減少纖維化大鼠ECM的生成。 進一步研究發(fā)現(xiàn)，SQDG顯著降低肝纖維化大鼠肝勻漿中MDA的含量，升高抗氧化酶SOD、GSH-Px活性，改善肝臟氧化狀態(tài)，還能顯著降低肝纖維化大鼠血清中升高的炎性細胞因子PGE2的產(chǎn)生。 提示：抑制氧化應激和致纖維化炎性細胞因子的產(chǎn)生，抑制PDGFR-β的表達從而抑制HSC增殖可能是SQDG抗肝纖維化的部分機制。 2.SQDG對免疫性肝

8、纖維化大鼠MAPK相關蛋白磷酸化和G蛋白表達的影響在豬血清誘導的免疫性肝纖維化模型大鼠中，肝組織ERK1/2、p38和JNK磷酸化程度增加，肝組織中Gas的表達明顯降低，Gai-2和Gai-3的表達明顯增加，而Gai-1的表達沒有明顯變化。 提示：影響MAPK和G蛋白通路的變化可能是SQDG發(fā)揮抗肝纖維化作用的重要機制之一。 3.Pae對rrPDGF-BB刺激HSC-T6增殖的影響體外建立rrPDGF-BB誘導的HSC

9、-T6增殖模型，結果表明Pae在12.5～200mg·L-1濃度范圍內(nèi)明顯抑制HSC-T6增殖。進一步觀察COX-2在rrPDGF-BB刺激HSC-T6增殖中的作用，結果表明rrPDGF-BB刺激可引起COX-2表達量持續(xù)增加，選擇性的COX-2抑制劑NS.398可以明顯抑制rrPDGF.BB誘導的HSC.T6增殖。Pae(50，100mg·L-1)可以明顯抑制rrPDGF-BB引起的HSC.T6 COX.2表達增加。 提示：抑

10、制COX.2的表達可能是Pae抑制HSC-T6增殖的作用機制之一。 4.Pae對rrPDGF.BB刺激的HSC.T6 ERK1/2信號通路活化的影響Western.blot檢測發(fā)現(xiàn)，rrPDGF.BB刺激HSC.T6可引起ERK1/2的迅速磷酸化，Pae(25，50，100 mg·L-1)可以抑制rrPDGF-BB引起的HSC-T6 ERK1/2的激活，降低p-ERK1/2水平。 提示：抑制rrPDGF.BB刺激的HSC

11、.T6 ERK1/2信號通路的活化是Pae抑制其增殖的主要機制之一。 5.rrPDGF.BB刺激下HSC.T6 G蛋白-AC.cAMP通路的改變及Pae的作用應用Western-blot方法，檢測rrPDGF-BB(50 μg·L-1)刺激HSC-T6中G蛋白.AC.cAMP通路的改變。結果發(fā)現(xiàn)，rrPDGF.BB可以明顯促進Gai.1和Gai.2蛋白表達水平，但對Gai.3和Gas表達無明顯影響。同時，rrPDGF-BB可以降

12、低細胞內(nèi)cAMP水平和PKA活性，促進HSC-T6增殖。Pae(50，100mg·L-1)可明顯抑制rrPDGF-BB引起的Gai.1、Gai.2的表達升高，提高細胞內(nèi)cAMP水平。且相關性與回歸分析結果表明Pae抑制rrPDGF.BB刺激的HSC.T6增殖反應與其提高HSC-T6內(nèi)cAMP水平密切相關。 提示：下調(diào)HSC.T6 Gai蛋白的表達是Pae抑制rrPDGF-BB刺激的HSC.T6過度增殖的重要機制之一。 6

13、.rrPDGF.BB刺激下HSC-T6 ERK1/2信號通路與Gai介導信號通路間的關系采用Gi特異性的抑制劑PT作用于HSC-T6，結果表明PT可抑制rrPDGF-BB誘導的HSC.T6的增殖及P.ERK1/2的表達，提示PT敏感的G蛋白對ERK1/2的激活具有調(diào)節(jié)作用。用MEK1/2特異性的抑制劑U0126抑制ERK1/2的激活，觀察其對rrPDGF.BB刺激下HSC.T6 PT敏感的G蛋白通路的影響。結果發(fā)現(xiàn)，U0126對Gai.

14、1和Gai.2蛋白表達水平?jīng)]有明顯影響。rrPDGF.BB刺激的HSC.T6細胞內(nèi)cAMP水平和PKA活性明顯下降，在rrPDGF.BB刺激下HSC.T6中加入U0126后，對降低的cAMP水平和PKA活性沒有明顯的影響。 提示：ERK1/2可能存在于PT敏感的Gi蛋白通路的下游發(fā)揮作用。Pae可能通過下調(diào)Gai表達，進而抑制ERK1/2的激活，發(fā)揮抑制rrPDGF.BB刺激HSC.T6異常增殖的作用。 結論：

15、1.SQDG具有明顯的抗肝纖維化作用，其機制與改善肝纖維化大鼠肝臟的氧應激狀態(tài)、抑制炎性細胞因子的生成、抑制HSC增殖等有關。 2.rrPDGF.BB刺激可引起COX.2表達量持續(xù)增加，選擇性的COX-2抑制劑NS-398可以明顯抑制rrPDGF.BB誘導的HSC.T6增殖。SQDG主要成分Pae可以明顯抑制rrPDGF.BB引起的HSC.T6 COX.2表達增加，抑制COX.2的表達可能是Pae抑制HSC.T6增殖的作用機制之

16、一。 3.rrPDGF.BB刺激HSC.T6可引起ERK1/2的迅速磷酸化。Pae(25，50，100 mg·L-1)可以抑制rrPDGF.BB引起的HSC.T6 ERK1/2的激活，降低p-ERK1/2水平。MEK抑制劑U0126可以抑制rrPDGF.BB引起的HSC.T6 COX-2表達增加。提示Pae可能通過抑制rrPDGF.BB刺激的HSC.T6 ERK1/2信號通路的活化，減少COX-2的表達發(fā)揮其抑制HSC.T6增殖

17、的作用。 4.rrPDGF.BB可以明顯促進Gai.1和Gai.2蛋白表達水平，降低細胞內(nèi)cAMP水平和PKA活性，Pae可明顯抑制rrPDGF.BB引起的Gai.1、Gai.2的表達升高，且Pae抑制rrPDGF.BB刺激的HSC.T6增殖反應與其提高HSC.T6細胞內(nèi)cAMP水平密切相關。Pae可能通過下調(diào)HSC.T6 Gai蛋白偶聯(lián)的信號通路抑制rrPDGF-BB刺激的HSC.T6過度增殖。 　　5.Gi特異性的抑