腦淋巴引流阻滯對(duì)SAH繼發(fā)性腦缺血損傷的影響及吡哆醇的緩解作用.pdf

1、研究背景： 急性腦血管病是人類三大致死性疾病之一，其中蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoidhemorrhage，SAH) 的發(fā)病率僅次于腦梗塞和腦出血，位居第三位。絕大多數(shù) SAH 系腦動(dòng)脈瘤破裂所致，其病死率高達(dá)25％以上，存活下來(lái)的患者約1/3因神經(jīng)功能缺損而需依賴他人生活，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。再出血和繼發(fā)腦缺血是導(dǎo)致 SAH患者嚴(yán)重預(yù)后的兩個(gè)主要并發(fā)癥。目前對(duì)腦動(dòng)脈瘤的閉塞術(shù)和血管內(nèi)栓塞術(shù)取得了很大的進(jìn)步，SAH

2、 后再出血率已顯著降低，但其總體預(yù)后并沒(méi)有顯著改善。因此，深入探討SAH后繼發(fā)腦缺血損傷的機(jī)制，尋找有效防治措施是改善SAH預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。 數(shù)十年來(lái)，SAH 后腦部主要?jiǎng)用}血管發(fā)生的痙攣和管腔狹窄，即所謂腦血管痙攣 (cerebral vasospasm，CVS) 一直是研究的焦點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)SAH 后 CVS 出現(xiàn)的時(shí)程和嚴(yán)重程度與繼發(fā)性腦缺血損傷并不呈完全平行的關(guān)系，除CVS外，SAH后腦微血管

3、痙攣和微循環(huán)調(diào)節(jié)功能異常等因素也與繼發(fā)性腦缺血的發(fā)生有關(guān)。神經(jīng)元的死亡可通過(guò)壞死(necrosis)和凋亡(apoptosis)兩種不同形式發(fā)生。哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡是受 Bcl-2蛋白家族、凋亡蛋白活化因子 1(apoptosis protein activating factor,Apaf-1)、caspase(胱冬肽酶)蛋白家族等調(diào)控的。caspase 家族成員歸居于不同的凋亡通路，其中 caspase-3 與凋亡密切相關(guān)。在線粒體對(duì)

4、細(xì)胞凋亡的調(diào)控中，Bcl-2 家族的蛋白質(zhì)對(duì)線粒體內(nèi)一些促凋亡因子的釋放具有調(diào)控功能，因此在決定細(xì)胞生死中也具有十分重要的作用。通過(guò)大分子物質(zhì)示蹤等技術(shù)在不同種屬動(dòng)物包括人類的研究已經(jīng)證實(shí)，腦內(nèi)和蛛網(wǎng)膜下腔中的大分子物質(zhì)可以被引流入顱外淋巴管和淋巴結(jié)。吡哆醇為維生素 B 族化合物，是機(jī)體內(nèi)一種重要輔酶，它以 5′-磷酸吡哆醛的形式參與了氨基酸、脂類等代謝和免疫反應(yīng)等過(guò)程。臨床上對(duì)淋巴滯留性腦病患者采用大劑量吡哆醇或泛酸治療能明顯減輕患者

5、癥狀，說(shuō)明吡哆醇能夠改善大分子物質(zhì)引流，但其機(jī)理不清。SAH繼發(fā)腦缺血發(fā)生后，大量血漿蛋白等大分子物質(zhì)可通過(guò)受損的血腦屏障進(jìn)入腦組織中；由細(xì)胞受損而產(chǎn)生的細(xì)胞裂解產(chǎn)物和缺血代謝瀑布產(chǎn)生的大量肽類等大分子物質(zhì)在腦組織中急劇增加。上述大分子物質(zhì)在腦組織中的積聚直接使神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)一步受損，或通過(guò)腦組織滲透壓升高而引起腦水腫甚至腦疝，導(dǎo)致患者神經(jīng)功能缺損乃至死亡。這些在蛛網(wǎng)膜下腔和腦組織內(nèi)積聚的大分子物質(zhì)被清除的程度如何，將對(duì) SAH的最終結(jié)局產(chǎn)

6、生極為重要的影響。然而，目前國(guó)內(nèi)外其他學(xué)者對(duì)SAH繼發(fā)腦缺血損傷的研究尚沒(méi)有涉及大分子物質(zhì)清除這一重要問(wèn)題。 研究目的： 1、進(jìn)一步闡明腦淋巴引流途徑在病理?xiàng)l件下腦組織大分子物質(zhì)引流和維持腦組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中的重要作用。 2、明確SAH后腦淋巴引流途徑變化特征，闡明腦淋巴引流途徑在SAH繼發(fā)腦缺血損傷中起到的內(nèi)源性保護(hù)作用。 3、從改善腦內(nèi)物質(zhì)的淋巴引流角度尋找有效防治SAH繼發(fā)腦缺血損傷的藥物。

7、研究方法： 1、選用健康成年 Wistar大鼠，雌雄不拘，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、SAH 組、SAH+CLB 組、SAH+CLB+ 吡哆醇組、SAH+CLB+ 生理鹽水組。采用頸淋巴管結(jié)扎和淋巴結(jié)摘除法制作大鼠腦淋巴引流阻滯(CLB)模型，應(yīng)用枕大池二次注血法建立大鼠SAH模型。于模型制作結(jié)束后12h內(nèi)，監(jiān)測(cè)有關(guān)生理指標(biāo)等變化。于第二次注血后48h在體觀察基底動(dòng)脈(BA)管徑變化，測(cè)定BA對(duì)乙酰膽堿(Ach)的反應(yīng)性，同時(shí)行組織病理

8、學(xué)觀察基底動(dòng)脈形態(tài)和管徑，并對(duì)腦膜微循環(huán)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行觀察。 2、對(duì)上述分組動(dòng)物，于術(shù)后48h，HE染色觀察大腦皮層和海馬的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；PI 染色觀察大腦皮層和海馬細(xì)胞核的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，采用TUNEL 熒光標(biāo)記法檢測(cè)大腦皮層和海馬原位凋亡。取新鮮大腦皮層和海馬，采用SABC免疫熒光技術(shù)檢測(cè)caspase-3 和 Bcl-2 的蛋白表達(dá)；利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè) caspase-3 和Bcl-2的mRNA表達(dá)。 研究結(jié)果

9、： 1、腦池注血的動(dòng)物除血壓一過(guò)性升高外，動(dòng)脈血?dú)獾壬碇笜?biāo)維持在正常范圍內(nèi)；SAH 組、SAH+CLB 組、SAH+CLB+生理鹽水組出現(xiàn)ICP升高和腦灌注壓(CPP)下降；BA 管腔明顯痙攣縮窄，管壁增厚，且對(duì)Ach反應(yīng)性降低；腦膜微動(dòng)、靜脈明顯痙攣，血流多呈泥沙樣流動(dòng)，甚至可見(jiàn)血流郁滯、擺動(dòng)等明顯異常，以 SAH+CLB組、SAH+CLB+溶媒組更為嚴(yán)重。吡哆醇可減輕CLB對(duì)SAH所致ICP升高、CPP下降、BA 痙攣和腦

10、膜微循環(huán)異常的變化。 2、(1)HE染色可見(jiàn)SAH組大鼠部分神經(jīng)元脫失，皺縮，核固縮、深染，SAH+CLB組腦組織及毛細(xì)血管壁明顯水腫，組織間隙增寬，內(nèi)含大量水腫液，腦血管壁水腫，神經(jīng)元分部稀疏，細(xì)胞皺縮、變形，核染色質(zhì)致密濃縮、邊集，部分核碎裂，部分神經(jīng)元周圍有空泡形成。吡哆醇組上述表現(xiàn)較SAH+CLB組有一定程度的減輕。(2)PI染色可見(jiàn)SAH組細(xì)胞部分凋亡，細(xì)胞核呈波紋狀或折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)，個(gè)別細(xì)胞核的染色質(zhì)

11、高度凝聚、邊緣化，呈新月形，SAH+CLB 組大鼠有大量細(xì)胞凋亡，且多屬于凋亡晚期：染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化，新月形，核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體。吡哆醇組凋亡細(xì)胞明顯減少。(3) TUNEL 法原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示SAH組散在較多的 TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞，SAH+CLB 組可見(jiàn)大量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，凋亡細(xì)胞多集中在大腦皮層、海馬、基底節(jié)區(qū)、脈絡(luò)叢、室管膜等部位，而以海馬、室管膜更為明顯。吡哆醇組可見(jiàn)散在 TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞。(4)免疫熒光技

12、術(shù)檢測(cè)到SAH組有較多的 caspase-3 免疫陽(yáng)性細(xì)胞，SAH+CLB組有大量caspase-3免疫陽(yáng)性細(xì)胞分布，吡哆醇組 caspase-3 免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較SAH+CLB組減少。SAH組可見(jiàn)較多的Bcl-2免疫陽(yáng)性細(xì)胞，SAH+CLB組可見(jiàn)少量Bcl-2免疫陽(yáng)性細(xì)胞分布，毗哆醇組 Bcl-2 免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較SAH+CLB組明顯增多。(5)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示SAH組大腦皮層和海馬caspase-3基因mRNA表達(dá)明顯高

13、于正常對(duì)照組，SAH+CLB組caspase-3 基因mRNA表達(dá)更高，吡哆醇組caspase-3基因的mRNA表達(dá)則較 SAH+CLB 組明顯減少。SAH 組 Bcl-2 基因mRNA表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組，SAH+CLB組Bcl-2基因mRNA 表達(dá)則更低，吡哆醇組caspase-3基因的mRNA表達(dá)則較SAH+CLB組明顯增高。 研究結(jié)論： 1、阻斷腦淋巴引流途徑可加重SAH后腦血管痙攣和基底動(dòng)脈的病理變化。

14、 2、阻斷腦淋巴引流途徑可降低SAH后腦部微循環(huán)灌流量，加重微血管痙攣，降低腦微血管流速。 3、吡哆醇干預(yù)對(duì)腦淋巴引流阻斷所致的SAH后腦血管痙攣和微循環(huán)異常具有一定緩解作用。 4、阻斷腦淋巴引流途徑將加重SAH所致腦水腫。 5、阻斷腦淋巴引流途徑可以通過(guò)下調(diào)Bcl-2表達(dá)，上調(diào)caspase-3 表達(dá)來(lái)加重 SAH繼發(fā)性腦缺血損傷。 6、吡哆醇干預(yù)對(duì)腦淋巴引流阻斷所致的SAH繼發(fā)性腦缺血損傷具有一定緩