促性腺激素釋放激素激動劑對卵巢顆粒黃體細胞GnRHR-LHR-StAR表達的影響.pdf

1、促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是下丘腦弓狀核合成的十肽激素，序列為(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-G1y-NH2)，已被證明是下丘腦一垂體一性腺軸的重要信息分子。生理情況下，GnRH以脈沖形式分泌，通過垂體門脈與垂體促性腺細胞表面特異性高親和力的GnRH-R結(jié)合，通過調(diào)控促性腺激---促卵泡生成激素(FSH)、黃體生成素(LH)的合

2、成與分泌，維持正常的生殖系統(tǒng)功能。 天然GnRH序列中第5-6，6-7，9-10位氨基酸鏈穩(wěn)定性差，易受肽鏈內(nèi)切酶作用而裂解，體內(nèi)血漿半衰期僅2-4分鐘。促性腺激素釋放激素類似物(GnRH-analogtle)分別在第6、10位以右旋氨基酸替代天然GnRH序列中甘氨酸，使其與GnRHR親和力增強20-100倍，延長了半衰期，增強了穩(wěn)定性?；贕nRH-analogue與GnRHR結(jié)合的方式和對垂體FSH、LH的作用分為GnRH激

3、動劑(Gorredottopin-releasinghormorle agorlist，GnRH-a)與 GnRH 拮抗齊0(Gonadotropin-releasing hormoneantagonist，GnRH-A)，激動劑給藥初期出現(xiàn)激發(fā)效應(yīng)刺激促性腺激素的釋放，持續(xù)給藥導(dǎo)致GnRH受體脫敏與下調(diào)，抑制促性腺激素的釋放，從而達到抑制垂體一卵巢軸功能，從而在臨床上表現(xiàn)出藥物性卵巢去勢作用。 基于GnRH-α初期給藥的激發(fā)現(xiàn)

4、象和持續(xù)給藥降調(diào)垂體-卵巢功能的作用，有利于增加卵泡的募集、抑制內(nèi)源性黃體生成素(LH)峰避免卵泡過早黃素化和提高卵子質(zhì)量等重要作用，從20世紀(jì)90年代開始，GnRH-a聯(lián)合促性腺激素方案已經(jīng)成為體外受精一胚胎移植(Ⅵ F-ET)中可控制性誘導(dǎo)排卵的常規(guī)方案。但隨著資料與數(shù)據(jù)的增加，發(fā)現(xiàn)GnRHa，對垂體一卵巢軸的過度抑制還可導(dǎo)致卵巢反應(yīng)性下降，使用Gn劑量增加、時間延長，影響卵子成熟和胚胎早期發(fā)育。此外，GnRH-a抑制顆粒細胞激素合

5、成和溶黃體作用，均不利于胚胎的著床和妊娠的繼續(xù)。由此提出探討GnRH-a對卵巢功能影響的基礎(chǔ)研究、以期尋找合理的GnRH-a劑量與方案。 GnRH與受體結(jié)合產(chǎn)生介導(dǎo)一系列生物學(xué)效應(yīng)。GnRH-R最早在垂體發(fā)現(xiàn)，主要分布于垂體前葉促性腺激素細胞。是分子量為60KD的糖蛋白，基因定位于4號染色體，包括3個外顯子和2個內(nèi)含子，是G蛋白偶連受體家族的成員。目前研究提示其合成受GnRH自身、類固醇激素(雌激素和孕激素)、激活素和抑制素四大因素調(diào)節(jié)

6、。此外，第二信使激活劑對GnRH-R基因表達也存在一定影響。 近年在下丘腦一垂體軸外組織，如子宮內(nèi)膜、卵巢、睪丸、胎盤和子宮肌等，尤其是人卵巢上皮細胞、腫瘤細胞系和排卵前卵泡與成熟黃體顆粒細胞層的GnRH及其受體表達研究[12，13，14]，提示其在GnRH對生殖功能的調(diào)控作用機制不僅包括垂體一卵巢軸的內(nèi)分泌途徑，還可能存在以旁/自分泌方式的直接作用。體外實驗研究結(jié)果顯示GnRH-a抑制顆粒黃體細胞孕酮分泌功能，但對低劑量GnR

7、H-a的作用與機制還缺乏研究。 膽固醇向孕烯醇酮轉(zhuǎn)化是卵巢類固醇激素生物合成的必經(jīng)途徑。類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regtllatory p rotein，StAR)是調(diào)控其限速步驟之一：膽固醇從線粒體外膜轉(zhuǎn)運至內(nèi)膜的的關(guān)鍵蛋白，它的表達受激素誘導(dǎo)調(diào)節(jié)。LH是StAR合成的主要上游調(diào)控通路，此外還存在其他信號如FSH、IGFs和EGF等的調(diào)節(jié)作用。 因此，在可控制性超排卵治療中，

8、了解GnRH-a劑量與方案對卵巢黃體功能的抑制程度與作用機制，有助于臨床醫(yī)師選擇合適的方案以提高妊娠率。本實驗針對這一問題，選取GnRHR、LHR、 StAR為研究指標(biāo)，擬通過：1)低劑量GnRH-a降調(diào)節(jié)對在體黃素化顆粒細胞；2)GnRH-a不同濃度干預(yù)體外顆粒黃體細胞培養(yǎng)的實驗研究，探討GnRH-a劑量對顆粒黃體細胞的調(diào)控。 第一部分低劑量GnRHa對在體黃素化顆粒細胞GnRHR/LHR/StAR表達的影響研究目的低劑量Gn

9、RHa對IVF-ET周期中黃素化顆粒細胞GnRHR/LHR/StAR表達的作用研究方法選擇在本中心行IVF-ET的患者20例20周期。實驗組為因單純輸卵管因素或男方因素進行IVF-ET治療的患者15例15周期，依黃體期GnRH-a長方案降調(diào)節(jié)劑量分為0.1mg/d，單次注射1.3 mg，1.8 mg三組，每組5例；對照組為僅采用FSH誘導(dǎo)卵泡發(fā)育擬行夫精人工授精治療后因卵泡發(fā)育較多轉(zhuǎn)為IVF-ET治療的患者5例5周期。收集取卵日黃素化顆

10、粒細胞，采用RT-PC免疫組化、Western Blot方法檢測GnRHR/LHR/StAR的mRNA和蛋白表達。 研究結(jié)果 1 GnRHR mRNA相對積分值在對照組組和實驗組(GnRH-a降調(diào)節(jié))三種劑量組(0.1mg/d，1.3 mg，1.8 mg)分別為0.654±0.142、0.625±0.108，0.631±0.144和0.596±0.126。(P>0.05)2．LHR mRNA相對積分值在無降調(diào)節(jié)組和GnR

11、H-a三種劑量組(0.1 mg/d，1.3 mg，1.8 mg)LHR mRNA表達相對積分值分別為1.524±0.263、1.479±0.216，1.451±0.249和1.330±0.198。 (P>0．05)3．StAR蛋白在各組黃素化顆粒細胞上均有表達4．StAR mRNA相對積分值在無降調(diào)節(jié)組和GnRH-a三種劑量組(0.1 mg/d，1.3 mg，1.8 mg)分別為1.276±0.212、1.311±0.149，1.341

12、±0.198和1.198±0.120。(P>0.05)，5．StAR蛋白相對積分值在無降調(diào)節(jié)組和GnRH-a三種劑量組(0.1 mg/d，1.3 mg，1.8 mg)分別為1.268±0.142、1.345±0.166，1.326±0.135和1.238±0.136。(P>0.05)第二部分 GnRHa對體外培養(yǎng)的顆粒黃體細胞GnRHR/StAR表達的作用研究目的GnRHa對體外培養(yǎng)顆粒黃體細胞GnRHR/StAR表達的作用研究方法收集

13、IVF-ET周期中予長效GnRHa(達菲林)1.3mg肌注長方案降調(diào)患者的取卵日顆粒黃體細胞，制成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為3×10<'5>/ml。每皿4ml接種于60mm培養(yǎng)皿，用含15﹪FBS、100 U/ml penicillin G、100 μg/ml streptomycin的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天換液一次。四天后培養(yǎng)液更換為含5﹪FBS的M199培養(yǎng)基，六小時后實驗組培養(yǎng)皿中分別加入終濃度為10<'11>、10<'-9>、1

14、0<'-7>、10<'-5>M的GnRHa，對照組不加GnRHa。培養(yǎng)24 h后，提取顆粒細胞總RNA及蛋白。以RT-PCR及Western-blot方法檢測GnRHR/StAR mRNA及蛋白表達。實驗均重復(fù)3次。 研究結(jié)論 1．GnRHRmRNAA相對積分值在在不同濃度GnRH-a干預(yù)組(0、10<'-11>、10<'-9>、10<'-7>、10<'-5>)分別為0.628±0.139、0.636±0.105，0.6

15、55±0.112、0.616±0.095和10.614±0.128。 (P>0.05)，2．GnRHR蛋白相對積分值在不同濃度GnRH-a干預(yù)組(0、10<'-11>、10<'-9>、10<'-7>、10<'-5>)分別為0.196±0.042、0.205±0.038，0.216±0.036、0.202±0.039和0.186±0.040。 (P>0.05)，3．StAR mRNA相對積分值在在不同濃度GnRH-a干預(yù)組(0、10<'-

16、11>、10<'-9>、10<'-7>、10<'-5>)分別為0.638±0.116、0.665±0.102，0.681±0.109、0.729±0.096和0.691±0.131。 (P>0.05)4．StAR蛋白相對積分值在不同濃度GnRH-a干預(yù)組(0、10<'-11>、10<'-9>、10<'-7>、10<'-5>)分別為0.696±0.102、0.713±0.076，0.770±0.098、0.773±0.116和0.784±