利拉魯肽聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療對(duì)STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠糖代謝的影響研究.pdf

1、目的:
　　1、采用密度梯度離心聯(lián)合差壁培養(yǎng)法,建立一種較理想的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BoneMarrowMesenchymalStemCells,BM-MSCs)體外培養(yǎng)擴(kuò)增體系。
　　2、在體外研究探討利拉魯肽(Liraglutide,LIRA)對(duì)BM-MSCs定向誘導(dǎo)分化的作用,并比較其與胰升糖素樣肽1(Glucagon-likePeptide-1,GLP-1)的誘導(dǎo)效果差異。
　　3、觀察利拉魯肽聯(lián)合骨髓間充質(zhì)

2、干細(xì)胞(LIRA+BM-MSCs)移植對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的1型糖尿病(Type1DiabetesMellitus,T1DM)大鼠胃腸道激素水平和胰島β及α細(xì)胞功能的影響。
　　方法:
　　1、依據(jù)骨髓細(xì)胞比重的差異性,利用大鼠淋巴細(xì)胞分離液初步分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞,再根據(jù)其差壁生長(zhǎng)特性,通過定期換液的方式對(duì)其中單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)一步純化,最后以流式細(xì)胞儀測(cè)定分離后P3代細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD29、CD90、CD73和C

3、D105,造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34以及白細(xì)胞表面標(biāo)志CD45,并在特定培養(yǎng)基下觀察其向成骨以及成脂細(xì)胞分化的能力。
　　2、在高糖、低糖加尼克酰胺的兩階段誘導(dǎo)基礎(chǔ)上,以GLP-1為對(duì)照,熒光定量PCR檢測(cè)巢蛋白(Nestin)、胰十二指腸同源盒1(PDX-1)、葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(GLUT-2)、胰島素(Ins)和胰高血糖素(GLu)等基因的水平,細(xì)胞免疫熒光測(cè)定胞漿Ins和GLu蛋白的表達(dá),觀察10nmol/

4、L利拉魯肽繼續(xù)誘導(dǎo)7天對(duì)BM-MSCs向胰島樣細(xì)胞分化的作用。
　　3、以60mg/kg劑量腹腔注射STZ制備T1DM大鼠模型,造模成功后隨機(jī)分為1型糖尿病模型對(duì)照組(T1DM組,n=10)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組(T1DM+BM-MSCs組,n=10)、利拉魯肽治療組(T1DM+LIRA組,n=10)、利拉魯肽聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組(T1DM+LIRA+BM-MSCs組,n=10)四組。定期監(jiān)測(cè)各組大鼠隨機(jī)血糖水平以及一般情

5、況變化;8周末,測(cè)定各組大鼠糖化血紅蛋白(HbA1c)、24h尿量以及24h尿蛋白水平;采用ELISA法檢測(cè)血清胰島素、C肽、胰高血糖素、胃泌素、膽囊收縮素和胰升糖素樣肽1等胃腸道激素的濃度;免疫組織化學(xué)染色檢查胰腺組織胰島素和胰高血糖素的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、顯微鏡下見分離的BM-MSCs形態(tài)均一、呈長(zhǎng)梭形;流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示:分離的BM-MSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD29、CD90、CD73和CD105,而

6、不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34和白細(xì)胞表面標(biāo)志CD45;BM-MSCs成骨及成脂誘導(dǎo)分化能力檢測(cè)陽(yáng)性。
　　2、添加利拉魯肽或GLP-1誘導(dǎo)后BM-MSCs進(jìn)一步呈聚集性生長(zhǎng),DTZ染色陽(yáng)性;熒光定量PCR檢測(cè)提示:與高糖加尼克酰胺誘導(dǎo)組比較,利拉魯肽誘導(dǎo)組和GLP-1誘導(dǎo)組Nestin的mRNA含量明顯減少(P<0.01),PDX-1、GK、GLUT-2、Ins以及GLu的含量均升高(P<0.05),利拉魯肽誘導(dǎo)組與GLP-1

7、誘導(dǎo)組比較,各基因含量均無明顯差異(P>0.05);細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)提示:未誘導(dǎo)組和高糖加尼克酰胺誘導(dǎo)組BM-MSCs胞漿Ins或Glu蛋白表達(dá)陰性,利拉魯肽誘導(dǎo)組和GLP-1誘導(dǎo)組BM-MSCs胞漿Ins和Glu蛋白均表達(dá)陽(yáng)性。
　　3、一般指標(biāo):與T1DM組比較,T1DM+BM-MSCs、T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs三組大鼠隨機(jī)血糖、HbA1c、24h尿量以及24h尿蛋白量均明顯降低(P<0.01),

8、其中各指標(biāo)水平均以T1DM+LIRA+BM-MSCs組最低(P<0.05)。
　　胃腸道激素:與T1DM組比較,T1DM+BM-MSCs、T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs三組血清胰島素、C肽、胃泌素以及膽囊收縮素的水平均明顯升高(P<0.05);T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs兩組胰升糖素樣肽1的水平明顯升高(P<0.05),胰高血糖素的水平明顯降低(P<0.05),T1DM+BM-MS

9、Cs組胰升糖素樣肽1和胰高血糖素的水平與T1DM組比較無差異(P>0.05)。與T1DM+BM-MSCs組比較,T1DM+LIRA組胰升糖素樣肽1的水平升高(P<0.05),胰高血糖素的水平降低(P<0.05),胰島素、C肽、胃泌素以及膽囊收縮素的水平無明顯差異(P>0.05);T1DM+LIRA+BM-MSCs組胰高血糖素的水平降低(P<0.05),胰島素、C肽、胃泌素、膽囊收縮素以及胰升糖素樣肽1的水平均明顯升高(P<0.05)。與

10、T1DM+LIRA組比較,T1DM+LIRA+BM-MSCs組胰島素、C肽、胃泌素以及膽囊收縮素的水平均明顯升高(P<0.05),而胰升糖素樣肽1和胰高血糖素的水平均無差異(P>0.05)。
　　相關(guān)性分析:8周末各組大鼠血清胰島素水平與胃泌素(r=0.544,P<0.01)、膽囊收縮素(r=0.710,P<0.01)和胰升糖素樣肽1(r=0.669,P<0.01)的水平呈正相關(guān),與胰高血糖素的水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.506,P<

11、0.01);血清胰高血糖素水平與胃泌素(r=-0.364,P<0.05)、膽囊收縮素(r=-0.433,P<0.01)和胰升糖素樣肽1(r=-0.591,P<0.01)的水平呈負(fù)相關(guān)。
　　胰腺免疫組化:與T1DM組比較,T1DM+BM-MSCs、T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs三組胰島素陽(yáng)性占胰島細(xì)胞面積比例均明顯升高(P<0.01),其中以T1DM+LIRA+BM-MSCs組的陽(yáng)性面積比例最高(P<0.0

12、1),T1DM+BM-MSCs組與T1DM+LIRA組比較,兩組無明顯差異(P>0.05);與T1DM組比較,T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs兩組胰腺組織胰高血糖素陽(yáng)性占胰島細(xì)胞面積比例均明顯降低(P<0.01),T1DM+BM-MSCs組無明顯差異(P>0.05);與T1DM+BM-MSCs組比較,T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs兩組胰腺組織胰高血糖素陽(yáng)性面積比例均明顯降低(P<0.01);

13、與T1DM+LIRA組比較,T1DM+LIRA+BM-MSCs組胰腺組織胰高血糖素陽(yáng)性占胰島細(xì)胞面積比例降低(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、通過密度梯度離心聯(lián)合差壁培養(yǎng)法可以一次性獲得大量的BM-MSCs。
　　2、利拉魯肽可以進(jìn)一步促進(jìn)BM-MSCs分化為胰島樣細(xì)胞,且誘導(dǎo)效果與GLP-1相當(dāng)。
　　3、利拉魯肽聯(lián)合BM-MSCs移植治療可通過提高T1DM大鼠機(jī)體的多種胃腸道激素水平和對(duì)胰島β及α細(xì)胞功