糖尿病來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療心肌梗死的相關(guān)研究.pdf

1、目的：
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）治療心肌梗死（MI）是 MI治療可選擇的治療手段之一，MSC可以通過(guò)旁分泌機(jī)制分泌多種細(xì)胞因子，發(fā)揮其抑制凋亡、促進(jìn)血管新生、調(diào)節(jié)心室重塑、改善心臟功能的作用。與MSC移植治療MI的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不同，其臨床試驗(yàn)的效果并不確切。其原因可能是臨床患者常合并其他疾病，如糖尿病等。目前關(guān)于糖尿病人的MSC的生物學(xué)特性及其基因表達(dá)差異尚無(wú)報(bào)道。本研究的目的是比較糖尿病來(lái)源與非糖尿病來(lái)源的MSC在基因表達(dá)方面

2、存在的差異，及其在治療心肌梗死方面的差異，發(fā)現(xiàn)可能引起這些差異的關(guān)鍵細(xì)胞因子（Bcl-2、Bcl-xL），并驗(yàn)證通過(guò)MSC修飾Bcl-xL是否可以增加MSC的存活率、改善心臟功能。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Affymetrix全基因組基因芯片技術(shù)進(jìn)行MSC功能基因表達(dá)譜分析，以期發(fā)現(xiàn)冠心病合并糖尿?。–AD+DM）患者與冠心病非糖尿?。–AD）患者M(jìn)SC基因表達(dá)的差異。并通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染基因修飾MSC的方式研究hBcl-xL

3、在增加MSC在心肌梗死區(qū)域存活率、促進(jìn)血管新生、抑制凋亡、改善心臟功能等方面的作用。主要內(nèi)容包括三部分：
　　1、冠狀動(dòng)脈旁路移植（CABG）術(shù)中獲取患者骨髓，體外擴(kuò)增MSC，收集第3代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀篩選鑒定、繪制生長(zhǎng)曲線、提取RNA制作基因芯片、比較基因表達(dá)差異。
　　2、CAD+DM與CAD患者M(jìn)SC移植到大鼠心肌梗死區(qū)域，觀察其對(duì)于心肌梗死的治療作用（抑制凋亡、改善心臟功能），以及Bcl-2、VEGF等表達(dá)情況。<

4、br>　　3、應(yīng)用慢病毒載體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)轉(zhuǎn)染hBcl-XL-IRES2-EGFP融合基因達(dá)到過(guò)表達(dá)，同時(shí)單獨(dú)轉(zhuǎn)IRES2-EGFP作為對(duì)照。通過(guò)熒光顯微鏡、WB方法驗(yàn)證病毒轉(zhuǎn)染效率；流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定是否增強(qiáng)細(xì)胞抗凋亡的能力、ELISA測(cè)定MSC在低氧培養(yǎng)基上清中細(xì)胞因子變化，確定基因修飾后細(xì)胞分泌功能的變化。進(jìn)而進(jìn)行治療心肌梗死的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察是否能夠提高M(jìn)SC在梗死區(qū)的存活率、抑制梗死區(qū)域的細(xì)胞凋亡、減少瘢痕形成、促進(jìn)血管新生、改善心臟功

5、能。
　　結(jié)果：
　　1、糖尿病患者來(lái)源的MSC具有MSC的生物學(xué)特性：表達(dá)CD29、CD44；不表達(dá)CD34、CD45，體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其增殖能力顯著低于非糖尿病患者來(lái)源的MSC；
　　2、Affymetrix基因芯片證實(shí)：CAD+DM組與CAD組MSC相比較，功能蛋白表達(dá)基因中涉及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的基因有27個(gè)，其中13個(gè)基因表達(dá)明顯上調(diào)，分別為T(mén)NFRSF10B、TNFRSF21、NGF、CAV

6、2、ITGA8、TNS1、ITGA2、AKT3、MBP、MAP2、INHBA、FST、PLA2G5；有14個(gè)基因表達(dá)明顯下調(diào)EPR1、BIRC5HELLS、BCL2、HGF、CASP1、SEPP1、ITGA9、MAP2K6RUNX3、TGFBR2、RUNX2、CTNNB1、CDC42。
　　3、CAD+DM組與CAD組MSC細(xì)胞移植到大鼠心肌梗死邊緣區(qū)均能顯著抑制心肌細(xì)胞凋亡、改善心臟收縮功能，但CAD+DM組這些作用與CAD組相

7、比顯著降低，可能與CAD+DM組移植后Bcl-2表達(dá)顯著低于CAD組有關(guān)。
　　4、慢病毒可以安全、有效的轉(zhuǎn)染hBcl-xL-IRES-EGFP融合基因、IRES-EGFP融合基因到MSC內(nèi)，EGFP的共轉(zhuǎn)染可以確定轉(zhuǎn)染效率并測(cè)定后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中MSC的存活率。研究顯示，病毒轉(zhuǎn)染未影響MSC的生物學(xué)特性，過(guò)表達(dá)hBcl-xL可以增加MSC分泌細(xì)胞因子和抗凋亡能力，Western Blot檢測(cè)、Annexin V/PI檢測(cè)、ELISA

8、檢測(cè)顯示，hBcl-xL基因修飾的MSC表達(dá)hBcl-xL顯著增加、抗凋亡能力增強(qiáng)、分泌VEGF、IGF-1、PDGF等細(xì)胞因子增加（p<0.05）。
　　5、hBcl-xL基因修飾的MSC移植治療心肌梗死的在體實(shí)驗(yàn)提示：過(guò)表達(dá)hBcl-xL的MSC在移植區(qū)域的存活率提高、可以顯著降低梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)毛細(xì)血管新生、減少瘢痕組織形成、改善心臟功能（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、糖尿病來(lái)源的MSC在細(xì)胞

9、增殖等方面與非糖尿病來(lái)源的MSC存在顯著差異，兩者存在基因表達(dá)差異，其Bcl-2表達(dá)顯著降低；
　　2、糖尿病來(lái)源的MSC治療大鼠心肌梗死療效與非糖尿病來(lái)源的MSC相比顯著降低；
　　3、應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)轉(zhuǎn)染使MSC高表達(dá)Bcl-xL后可以顯著提高M(jìn)SC在低氧條件下的抗凋亡能力、顯著增加VEGF、IGF-1、PDGF等細(xì)胞因子的分泌。
　　4、高表達(dá)Bcl-xL的MSC移植到心肌梗死區(qū)域可以顯著提高M(jìn)SC的存活率、抑