明日葉查爾酮的制備及其對小鼠H22肝癌血管生成的抑制作用研究.pdf

1、目的：研究建立從明日葉中提取查爾酮(Angelica keiskeiKoidzumi chalcone，英文簡稱 AC)的方法并制備實驗樣品。應用紫外光譜、紅外光譜、高效液相色譜法等技術(shù)手段檢測明日葉查爾酮的含量及其結(jié)構(gòu)特征；釆用動物實驗的方法，觀察明日葉查爾酮對小鼠H22肝癌血管生成的抑制作用。
　　方法：包括明日葉查爾酮的制備分析與對小鼠H22肝癌血管生成的抑制作用等兩部分內(nèi)容的實驗方法：
　　1明日葉查爾酮的提取、純化

2、與分析
　　1.1明日葉查爾酮的提取
　　以新鮮明日葉為原料，經(jīng)制漿→溶劑萃取→樣品收集、處理→提取量檢測及得率計算等方法步驟獲得查爾酮粗品，通過分別考察提取劑組分、料液比、提取時間、溫度及次數(shù)等單因素及其多因素（正交實驗法）對提取效果的影響情況，最終篩選出最佳提取工藝條件。
　　1.2明日葉查爾酮的純化
　　將提取的明日葉查爾酮粗品采用層析法，經(jīng)醇溶→過濾→上柱吸附（聚酰胺或大孔樹脂）→水洗→脫附→檢驗→濃縮→

3、干燥等工藝處理后，獲得明日葉查爾酮純品。
　　1.3制備樣品的分析
　　1.3.1制備樣品中查爾酮的含量測定
　　將純化樣品經(jīng)硝酸鋁顯色測定吸光度，而后由蘆丁標準樣線性回歸方程得出樣品中查爾酮的含量，進而計算提取得率和樣品純度。
　　回歸方程：CX（mg/mL）=（Y+0.0002）/0.484
　　CX—樣品中查爾酮濃度（mg/mL）
　　Y—樣品的吸光度A
　　提取得率：粗品（％）=粗品重量

4、/明日葉重量×100%
　　純品（%）=純品重量/明日葉重量×100%
　　樣品純度：粗品（%）=查爾酮含量/粗品重量×100%
　　純品（%）=查爾酮含量/純品重量×100%
　　1.3.2制備樣品的紫外光譜分析
　　用紫外光譜法測定制備的明日葉查爾酮樣品的基本骨架結(jié)構(gòu)。
　　1.3.3制備樣品的紅外光譜分析
　　用紅外光譜法測定制備的明日葉查爾酮樣品的特征吸收峰。
　　1.3.4制備樣

5、品的高效液相色譜分析
　　用高效液相色譜法測定制備的明日葉查爾酮樣品的組分。
　　2明日葉查爾酮對肝癌血管生成的抑制作用研究
　　2.1動物實驗方法
　　將原代 H22肝癌細胞接種于小鼠腹腔，在接種后第6天，無菌條件下抽取腹水并制備成肝癌細胞懸液，在每只受試小鼠的右腋窩處接種2mL。設(shè)腫瘤對照組、低、中、高劑量明日葉查爾酮組和恩度組共5個組，每組10只，雌雄各半。明日葉查爾酮劑量組分別為5、25、50 mg/kg

6、，每天經(jīng)口灌胃給藥1次，連續(xù)10天。恩度組和腫瘤對照組則給予生理鹽水灌胃，恩度組腹腔注射恩度經(jīng)口灌胃等量生理鹽水4 mg/kg劑量。各組均在接種后第11天摘眼球取血并處死動物，取瘤組織待檢。
　　2.2檢測指標
　　2.2.1瘤質(zhì)量和抑瘤率：用電子天平稱取小鼠瘤重并計算得出抑瘤率。
　　抑瘤率=[腫瘤對照組瘤質(zhì)量(g)-用藥組瘤質(zhì)量(g)]/腫瘤對照組瘤質(zhì)量(g)×100%
　　2.2.2瘤細胞增殖活性：用四甲基

7、偶氮唑（MTT）法檢測各組小鼠腫瘤細胞的增殖活性。
　　2.2.3瘤組織中微血管密度（MVD）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達水平：用免疫組化法檢測。
　　2.2.4瘤組織中缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）濃度檢測：用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）法檢測。
　　結(jié)果：
　　1明日葉查爾酮的提取、純化與分析
　　1.1明日葉查爾酮的提取
　　明日葉查爾酮粗品的最優(yōu)制備工藝為：采用水-乙醇二元萃取體系

8、，水:乙醇體積分數(shù)35:65，溫度60℃，時間1 h，料液比1:10，提取1次，粗品提取得率為3.38%。
　　1.2明日葉查爾酮的純化
　　聚酰胺層析柱分離法純化明日葉查爾酮優(yōu)于 AB-8大孔樹脂分離法，經(jīng)純化后與先前制得的粗品相較純度提升12倍以上。
　　1.3制備樣品的分析
　　1.3.1制備樣品中查爾酮的含量測定
　　制備的查爾酮粗品及純品中查爾酮的含量分別為0.575 mg與7.250 mg，純度

9、則分別為7.71%及96.6%。
　　1.3.2明日葉查爾酮的紫外光譜分析
　　制備的查爾酮純品在380 nm處有最大吸收，與標準查爾酮樣品相同。
　　1.3.3明日葉查爾酮的紅外光譜分析
　　制備的查爾酮純品紅外光譜顯示，其結(jié)構(gòu)中含有酚羥基、羰基、甲基、亞甲基、碳氧鍵和苯環(huán)結(jié)構(gòu)等明日葉查爾酮衍生物應具備的結(jié)構(gòu)特征。
　　1.3.4明日葉查爾酮的高效液相色譜分析
　　制備的明日葉查爾酮樣品是含有的8種

10、查爾酮衍生物的混合物。本工藝未獲得單一成分的明日葉查爾酮衍生物。
　　2明日葉查爾酮對肝癌血管生成的抑制作用研究
　　2.1瘤重及抑瘤率：腫瘤對照組與高劑量AC組的平均瘤重分別為0.548±0.021g與0.332±0.032g，低劑量與高劑量AC組抑瘤率分別為4.20%、39.42%，差異均有顯著性意義（p＜0.05）。
　　2.2瘤細胞增殖活性：中、高劑量AC組腫瘤細胞增殖活性分別為0.657±0.073、0.50

11、6±0.032，較腫瘤對照組（1.330±0.089）顯著性降低（P＜0.05）。
　　2.3 MVD和VEGF表達：中、高劑量AC組MVD計數(shù)分別為7.2±1.135、4.5±1.286，與腫瘤對照組（9.9±1.175）比較，均有顯著性差異（P＜0.05）；中、高劑量AC組的VEGF陽性表達率分別為26.12％和12.22％，與腫瘤對照組（56.26％）相比差異有顯著意義（P＜0.05）。
　　2.4 HIF-1α濃度：

12、中、高劑量AC組HIF-1α濃度分別為81.16±10.31ng/L、77.34±11.39ng/L，腫瘤對照組則為88.92±11.73ng/L，二者差異具有顯著意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：本研究通過上述實驗結(jié)果得出以下結(jié)論：
　　1.本研究以新鮮明日葉為原料，經(jīng)過對四種萃取體系的優(yōu)化工藝條件和提取得率進行比較，最終建立明日葉查爾酮粗提品的最優(yōu)制備工藝為：采用水-乙醇二元萃取體系，水:乙醇體積比35:65，溫度60℃

13、，時間2h，料液比1:10，提取1次，提取得率為3.38%。
　　2.查爾酮粗提品經(jīng)過層析法純化工藝處理后，純度提高12倍以上，說明色譜分離柱的分離提純效能顯著。聚酰胺層析柱分離提純效果好于AB-8大孔樹脂。
　　3.經(jīng)提取純化的明日葉查爾酮樣品在紫外380 nm處有最大吸收；紅外光譜顯示該樣品含有酚羥基、羰基、甲基、亞甲基、碳氧鍵和苯環(huán)結(jié)構(gòu)，具備明日葉查爾酮衍生物應有結(jié)構(gòu)特征；高效液相色譜分析結(jié)果則證明該樣品含有8種查爾酮

14、衍生物組分。
　　4.明日葉查爾酮可抑制肝癌細胞的增殖活性和腫瘤的生長，下調(diào)瘤細胞中MVD、VEGF的表達水平，降低HIF-1α的濃度，表明明日葉查爾酮對小鼠H22肝癌及其血管生成有一定抑制作用。
　　5.本研究創(chuàng)新點主要有：
　?。?）建立了一種直接從新鮮明日葉中直接提取查爾酮的方法。該方法具有快速、高效、綠色、節(jié)能、操作簡便的特點，適合工業(yè)化應用。該方法申請了國家發(fā)明專利并已獲得授權(quán)。
　?。?）建立了從新鮮