桑樹枝條韌皮部桑根皮素的制備及其對(duì)小鼠H22細(xì)胞株移植性腫瘤的抑制作用.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)主要以桑樹栽培種湖桑32號(hào)的桑樹枝條韌皮部（簡(jiǎn)稱桑枝皮）為試驗(yàn)材料，采用無水乙醇提取、大孔樹脂的吸附與分離、葡聚糖凝膠柱洗脫和半制備反相高效液相色譜（RP-HPLC）分離純化等方法，經(jīng)過高效液相色譜二級(jí)管陳列檢測(cè)（HPLC-DAD）和與標(biāo)準(zhǔn)品紫外光譜比對(duì)分析與鑒定，分離到的高純單體為桑根皮素（morusin）。以桑根皮素標(biāo)準(zhǔn)品繪制的線性方程定量分析待測(cè)樣品中桑根皮素的含量，桑根皮素在0.05-1.00μg范圍內(nèi)與其吸光度值具有很好

2、的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為 R2=0.9996。同時(shí)，應(yīng)用HPLC-DAD色譜法測(cè)定桑枝皮中桑根皮素的重現(xiàn)性和回收率分別為6.02%和100.62%。桑樹不同部位中桑根皮素的含量分析結(jié)果顯示，湖桑32的桑枝皮中桑根皮素含量與根皮中含量相差甚微，而在桑葉中沒有發(fā)現(xiàn)桑根皮素的存在；桑品種為延邊秋雨的桑枝皮中桑根皮素含量約是其根皮中的3倍。100個(gè)桑樹栽培品種的桑枝皮中桑根皮素含量差異顯著，高低可達(dá)20倍之多。湖桑32枝條皮中桑根皮素含量為200

3、.22μg/g，湖桑13號(hào)品種的桑枝皮中含量最高為585.81μg/g，而引三桑品種的枝條皮中其含量最低僅為29.64μg/g。本試驗(yàn)結(jié)果表明，本文應(yīng)用的 RP-HPLC-DAD分析法對(duì)鑒定和分析桑樹或桑枝皮中桑根皮素的方法快速、可靠。我們可以從大量廢棄的桑樹枝條皮中大量提取和回收具有抗腫瘤、抗菌、抗艾滋病毒等活性成份—桑根皮素，為農(nóng)業(yè)廢棄物桑樹枝條的高效利用和高附加值的開發(fā)打下良好的基礎(chǔ)。
　　為了研究桑根皮素抗腫瘤等方面的作用

4、機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)利用分子生物學(xué)的方法，定量檢測(cè)某些相關(guān)抗腫瘤基因的表達(dá)情況。通過小鼠肝癌腫瘤細(xì)胞株的移植，建立了移植瘤H22肝癌腫瘤小鼠的模型，采用腹腔注射的治療方式，研究了桑根皮素抑制腋下 H22實(shí)體瘤荷瘤模型小鼠腫瘤的發(fā)育情況和病理組織學(xué)的變化。隨機(jī)將H22移植瘤肝癌小鼠分為5組：注射生理鹽水的模型組，注射桑根皮素低（10 mg/kg·d）、中（20 mg/kg·d）、高（40 mg/kg·d）劑量的樣品處理組，以及注射抗腫瘤藥物的5-

5、氟尿嘧啶為陽(yáng)性對(duì)照組，給藥10 d，剖去瘤塊、脾臟和肝臟，計(jì)算抑瘤率及肝臟、脾臟系數(shù)增長(zhǎng)率和體質(zhì)量增長(zhǎng)率；采用HE染色對(duì)腫瘤和肝臟進(jìn)行病理觀察；以腫瘤模型組為對(duì)照，桑根皮素低、中、高劑量注射組及5-氟尿嘧啶陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用，抑瘤率分別為13.84%、26.21%、34.43%和47.21%；肝臟和脾臟系數(shù)增長(zhǎng)率及體質(zhì)量增長(zhǎng)率結(jié)果顯示，桑根皮素對(duì)小鼠肝臟、腎臟和體質(zhì)量增長(zhǎng)無明顯影響。
　　以5-氟尿嘧啶注

6、射組為實(shí)驗(yàn)對(duì)照的熒光定量PCR（QPCR）定量分析研究表明，經(jīng)桑根皮素處理的 H22小鼠與模型組相比，桑根皮素各劑量注射組的 P53、Caspase-3、Survivin和CyclinB1基因表達(dá)顯著上升，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。桑根皮素低、中、高劑量治療組中Caspase-3的基因表達(dá)水平均明顯高于模型組（P＜0.01）；其低劑量組Caspase-3基因表達(dá)水平大大高于模型組達(dá)4倍以上，中、高劑量實(shí)驗(yàn)組Caspase-3基因表

7、達(dá)水平雖低于低劑量組，但也分別高于模型組3.6和3.0倍。隨著注射桑根皮素濃度的上升，樣品處理組的抑制效果呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，即呈劑量-效應(yīng)的逆向關(guān)系。荷瘤模型組中NF-κB基因表達(dá)水平最高，高劑量樣品注射組 NF-κB基因表達(dá)量最低，與模型組表達(dá)量相比下調(diào)到36.5%。這三個(gè)劑量的桑根皮素樣品注射組對(duì) NF-κB基因表達(dá)的下調(diào)作用都達(dá)到非常顯著的水平（p＜0.01）。根據(jù)以上熒光定量分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以推測(cè)桑根皮素的抗肝癌作用的機(jī)制是通