心肌肥厚預(yù)適應(yīng)通過上調(diào)S100A8-A9抑制心肌肥厚以及延緩心衰進(jìn)程.pdf

1、研究背景與研究目的：
　　 心肌肥厚以心肌細(xì)胞蛋白合成增加和細(xì)胞體積增大為主要特征，是心臟功能從代償期向失代償期演變，心臟結(jié)構(gòu)從可逆性改變向不可逆性改變發(fā)展的關(guān)鍵階段，是心力衰竭的重要病理生理基礎(chǔ)。雖然一定程度的心肌肥厚可以減輕室壁壓力，幫助心肌代償性適應(yīng)增加的壓力負(fù)荷，但是細(xì)胞內(nèi)持續(xù)的促肥厚信號(hào)刺激是導(dǎo)致心衰進(jìn)展的主要不利因素。越來越多的實(shí)驗(yàn)研究和臨床觀察注意到，壓力負(fù)荷的撤除，比如主動(dòng)脈瓣狹窄置換術(shù)后的病人或解除主動(dòng)脈縮窄后

2、的動(dòng)物，肥厚的心肌能夠得以消退。在撤除壓力負(fù)荷肥厚消退期間，一些抗肥厚分子發(fā)揮著作用。另外有研究報(bào)道，間斷壓力負(fù)荷可改善小鼠心功能，并抑制心肌肥厚反應(yīng)和降低胚胎基因表達(dá)水平。但是目前還不清楚的是短期或長(zhǎng)期的壓力負(fù)荷的撤除能否使心臟對(duì)后續(xù)持續(xù)的肥厚刺激產(chǎn)生保護(hù)作用。
　　 自1986年Murry等首次報(bào)道了心肌缺血預(yù)適應(yīng)現(xiàn)象以來，引起了人們極大的關(guān)注，即反復(fù)短暫的缺血再灌注可以使心臟抵抗后續(xù)持續(xù)的缺血。除了缺血外，缺氧及藥物等也可

3、以引起機(jī)體適應(yīng)現(xiàn)象。那么在機(jī)體中是否也存在“心肌肥厚預(yù)適應(yīng)”現(xiàn)象呢？有一項(xiàng)研究報(bào)道了在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，短暫的抗高血壓治療可使抗心肌肥厚作用延長(zhǎng)而保護(hù)心臟。另外，有研究報(bào)道心臟壓力負(fù)荷撤除后基因表達(dá)譜發(fā)生了改變，其中一些基因具有抗肥厚作用，這提示我們肥厚刺激因素的撤除可能會(huì)產(chǎn)生抗肥厚記憶，但并不清楚這種記憶能持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間。
　　 相似程度的壓力負(fù)荷（如高血壓）可能會(huì)導(dǎo)致不同程度的心肌肥厚，心肌肥厚在原發(fā)性高血壓病人中的患病率不到50％

4、，提示一些病人中存在能抵抗肥厚刺激的保護(hù)因素。有實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)存在抗高血壓非依賴性的心肌肥厚抑制因子。但是如何誘導(dǎo)這樣的心肌肥厚抑制因子而使之成為有效的治療手段，還有待研究。基于以上證據(jù)，我們首次提出“心肌肥厚預(yù)適應(yīng)”現(xiàn)象的假設(shè)，即短期肥厚刺激可能對(duì)后續(xù)持續(xù)的肥厚刺激有抵抗作用，并延緩心衰進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)的目的在于驗(yàn)證“心肌肥厚預(yù)適應(yīng)”現(xiàn)象，以及探討其機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　 分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞

5、，實(shí)驗(yàn)分為三組:(1)去甲腎上腺素(NE)組:1μmol/L去甲腎上腺素（norepinephrine，NE，溶于DMEM）刺激48 h;(2) NE預(yù)適應(yīng)(NE+PRE)組:1μmol/L NE刺激12h，去除刺激12h，再用1μmol/L NE刺激48 h;(3)對(duì)照(Control)組:DMEM48 h。普通PCR及Real-time PCR法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞心房鈉尿肽(ANP)和β肌球蛋白重鏈(β-MHC)的表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光檢

6、測(cè)心肌細(xì)胞面積。
　　 2.藥物在體誘導(dǎo)心肌肥厚模型的建立
　　 8周齡C57BL/6雄性小鼠，體重20-25 g，戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔麻醉。背部手術(shù)區(qū)域脫毛、消毒。剪開皮膚，將植入式膠囊滲透壓泵埋入皮下，縫合皮膚。實(shí)驗(yàn)分3組，每組6-7只:(1) PE（phenylephrine，PE;苯腎上腺素）組:PE刺激4 d;(2) PE預(yù)適應(yīng)組:PE刺激1d后，休息1d，然后PE刺激2d，休息2d，最后PE再刺激

7、4 d;(3)對(duì)照組則是用藥物溶劑維生素C刺激4d。4d后檢測(cè)心重體重比(HW/BW mg/g)。PE用量為30mg/kg/d。
　　 3.主動(dòng)脈弓縮窄(TAC)誘導(dǎo)心肌肥厚模型的建立
　　 8周齡C57BL/6雄性小鼠，體重約20-25 g，戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉，人工呼吸。胸骨左側(cè)第二肋間開胸，暴露主動(dòng)脈弓。鈍性分離頭臂干和左頸總動(dòng)脈之間組織，7-0絲線結(jié)扎主動(dòng)脈弓和27G墊針，撤出墊針造成60-80

8、％的血管狹窄。
　　 4.超聲心動(dòng)圖測(cè)定心臟結(jié)構(gòu)及功能
　　 在TAC術(shù)后35d，采用M型超聲心動(dòng)圖對(duì)小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行評(píng)估。測(cè)量左室收縮和舒張末期內(nèi)徑(LVESd、LVEDd)，左室后壁收縮末和舒張末厚度(Pws、Pwd)，計(jì)算左室短軸縮短率:LVFS=(LVEDd-LVESd)/LVEDd×100。
　　 5.組織學(xué)檢測(cè)
　　 小鼠心臟置于4％多聚甲醛中固定，石蠟包埋，心臟切片約4-6μm，HE染

9、色，Masson染色，顯微鏡下觀察照相，Image J軟件計(jì)算心肌細(xì)胞橫截面積及纖維化面積。
　　 6.TAC模型誘導(dǎo)小鼠肥厚預(yù)適應(yīng)的方案
　　 實(shí)驗(yàn)分為以下二種方案，每組6-7只。
　　 方案一，通過左室超壓負(fù)荷引起心肌肥厚并觀察肥厚預(yù)適應(yīng)的早期保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)(Sham)組、TAC組及TAC預(yù)適應(yīng)(TAC+PRE)組。Sham組及TAC組的觀察時(shí)間均為7d。在TAC+PRE組則在TAC3 d后解除血管

10、狹窄，過4d再次開胸進(jìn)行TAC手術(shù)，連續(xù)觀察7d。
　　 方案二，通過左室超壓負(fù)荷誘導(dǎo)心肌肥厚并觀察肥厚預(yù)適應(yīng)的后期保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)分為Sham組、TAC組及TAC+PRE1和TAC+PRE2組。Sham組和TAC組連續(xù)觀察6周。TAC+PRE1組在TAC3 d后解除結(jié)扎，過4d后再次行TAC手術(shù)，隨后連續(xù)觀察6周;TAC+PRE2組則在TAC術(shù)1周后，于第8d解除結(jié)扎，過1周后，再次開胸行TAC手術(shù)，而后連續(xù)觀察6周。
　

11、　 7.S100鈣結(jié)合蛋白A8/A9(S100A8/A9)的表達(dá)水平
　　 Real-time PCR和Western blot檢測(cè)小鼠心臟及培養(yǎng)的心肌細(xì)胞S100鈣結(jié)合蛋白A8(S100A8)，S100鈣結(jié)合蛋白A9(S100A9)的基因表達(dá)水平和S100A9蛋白表達(dá)水平。
　　 8.S100A8/A9對(duì)心臟細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)方案
　　 體外分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞及心臟成纖維細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)NE刺激組:1μm

12、ol/L NE刺激48 h;(2)NE+S100A8刺激組:1μmol/L去甲腎上腺素和S100A8(1 ug/ml)刺激48 h;(3)NE+S100A9刺激組:1μmol/L去甲腎上腺素和S100A9(1 ug/ml)刺激48 h;(4) NE+S100A8/A9刺激組:1μmol/L去甲腎上腺素和S100A8/A9(1 ug/ml)刺激48 h;(5)對(duì)照組:DMEM48 h。心肌細(xì)胞用于檢測(cè)心肌細(xì)胞面積，ANP、β-MHC和鈣調(diào)

13、神經(jīng)磷酸酶(calcineurin)的表達(dá)以及活化T細(xì)胞核因子(NFAT)的核轉(zhuǎn)位，心臟成纖維細(xì)胞檢測(cè)基因水平前膠原Ⅰ型(procollagenⅠ)和Ⅲ型(procollagenⅢ)的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.肥厚預(yù)適應(yīng)的體外抗肥厚作用
　　 與Control組相比，NE組心肌細(xì)胞ANP（ANP/β-actin:1.00±0.06 vs.2.53±0.05，P=0.000）和β-MHC(β-MHC/β-ac

14、tin:0.98±0.02 vs.2.67±0.15,P=0.000)的表達(dá)水平明顯上調(diào)，而NE+PRE組可以部分抑制上述兩種基因的表達(dá)水平(P＜0.05-0.001)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示:與NE組相比，NE+PRE組心肌細(xì)胞面積減少了29％(2.29±0.02 vs.1.62±0.02 folds of control，P=0.000)。
　　 2.肥厚預(yù)適應(yīng)的在體抗肥厚作用
　　 在PE誘導(dǎo)心肌肥厚的小鼠中，與PE

15、組相比，PE+PRE組小鼠心重體重比顯著性下降（4.18±0.06 vs.4.02±0.04 mg/g，P=0.044）。與此相似，TAC1周后的小鼠，TAC+PRE組的心重體重比顯著低于TAC組(5.35±0.17 vs.5.99±0.22 mg/g，P=0.014)。TAC6周后的小鼠，兩個(gè)預(yù)適應(yīng)組小鼠心重體重比相比TAC組也顯著性下降(TAC+PRE1:5.32±0.14，TAC+PRE2:5.43±0.11，TAC:7.16±0

16、.33 mg/g，P＜0.01)，而且相比TAC組，TAC+PRE1和TAC+PRE2組的心肌細(xì)胞面積減小，以及抑制胚胎基因ANP和β-MHC的上調(diào)。
　　 3.肥厚預(yù)適應(yīng)抑制心臟重構(gòu)
　　 TAC組小鼠的超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果顯示，PWs、PWd、LVEDD和LVESD在TAC術(shù)后35天較sham組顯著增加（P≤0.001）。相比之下，肥厚預(yù)適應(yīng)減緩了左室室壁厚度的增加以及左室心腔的擴(kuò)大(與TAC組相比，各組P值均＜0.0

17、5)。而且組織學(xué)結(jié)果顯示，相比TAC組，兩個(gè)預(yù)適應(yīng)組的心肌纖維化程度明顯減輕。
　　 4.肥厚預(yù)適應(yīng)保護(hù)心功能
　　 肺重體重比的增加可反映TAC誘導(dǎo)的充血性心力衰竭。TAC6周后，兩個(gè)預(yù)適應(yīng)組肺重體重比顯著低于TAC組(5.98±0.12 and6.15±0.11 vs.9.88±1.00 mg/g，P=0.008和0.046)。另外，TAC術(shù)后35天，TAC組的左室短軸縮短率(LVFS)較Sham組顯著性下降(P＜0

18、.001);而TAC+PRE1和TAC+PRE2各組LVFS的下降幅度均顯著性低于TAC組（各組P值均＜0.05）。
　　 以上結(jié)果顯示了肥厚預(yù)適應(yīng)抑制心肌肥厚以及延緩心衰進(jìn)程。接下來我們?cè)囍鴮で笃淇赡艿臋C(jī)制。
　　 5.在解除壓力刺激后S100A8/A9顯著上調(diào)
　　 有研究報(bào)道心肌肥厚消退期一些基因特異性表達(dá)升高，S100A9就是其中之一。因此，我們檢測(cè)肥厚刺激因素解除后S100A8和S100A9表達(dá)水平的變

19、化。在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，S100A8和S100A9的mRNA表達(dá)水平及S100A9蛋白表達(dá)水平在對(duì)照組和NE組之間無明顯差異，而促肥厚刺激NE解除12h之后顯著升高。與此相似，TAC3天或1周后，解除結(jié)扎1天后小鼠心肌S100A8和S100A9的mRNA表達(dá)水平及S100A9蛋白表達(dá)水平顯著升高。
　　 6.S100A8/A9抑制心肌肥厚和纖維化
　　 我們進(jìn)一步研究了S100A8和S100A9蛋白對(duì)于心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)

20、胞的作用。與對(duì)照組相比，NE組心肌細(xì)胞ANP(ANP/β-actin:1.04±0.17 vs.5.52±1.32,P=0.000)和β-MHC(β-MHC/β-actin:1.03±0.16 vs.4.22±1.36， P=0.004)及成纖維細(xì)胞procollagenⅠ和procollagenⅢ的表達(dá)水平明顯上調(diào)，而用S100A8、S100A9或S100A8/A9處理可以部分抑制上述基因的表達(dá)水平（各組P值均＜0.05）。與NE組相

21、比，用S100A8，S100A9或S100A8/A9處理均可減小心肌細(xì)胞面積。
　　 7.S100A8/A9抑制calcineurin/NFAT促肥厚信號(hào)通路
　　 與對(duì)照組相比，NE組心肌細(xì)胞calcineurin（calcineurin/β-actin:0.18±0.02vs.0.55±0.02，P=0.000）的表達(dá)水平明顯上調(diào)，而用S100A8、S100A9或S100A8/A9處理均可抑制上述變化（各組P值均＜0

22、.05）。用Westemblot檢測(cè)NFATc3的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示對(duì)照組NFATc3主要定位于細(xì)胞漿，NE刺激后轉(zhuǎn)位入核，而用S100A8，S100A9或S100A8/A9處理均可抑制NE誘導(dǎo)的NFATc3核轉(zhuǎn)位。
　　 結(jié)論:
　　 1.促肥厚因素預(yù)刺激可增強(qiáng)心肌細(xì)胞的抗肥厚能力，延緩從心肌肥厚過度到心力衰竭的病理生理進(jìn)程，即存在“心肌肥厚預(yù)適應(yīng)”現(xiàn)象。
　　 2.心肌肥厚預(yù)適應(yīng)具有抗心肌肥厚、抑制心臟重構(gòu)