糖化血紅蛋白酶聯(lián)免疫直接競爭檢測技術(shù)的研究.pdf

1、背景：目前臨床上評價糖尿病血糖控制的金標(biāo)準(zhǔn)是檢測血液中HbA1c的含量,現(xiàn)在HbA1c有多種檢測方法,例如離子交換高壓液相色譜分析法、陽離子交換樹脂微柱層析法、親和色譜微柱法、免疫凝集抑制法等。但是到目前為止這些方法還沒有一種能做到既準(zhǔn)確、受干擾因素少,又經(jīng)濟(jì)、快速。
　　目的：根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附分析實驗的原理及HbA1c的化學(xué)結(jié)構(gòu),利用針對HbA1cβ鏈的特異性抗原決定簇的單克隆抗體來構(gòu)建競爭ELISA方法,用于檢測HbA1c,并

2、對該方法進(jìn)行初步考核。
　　方法：采用簡易過碘酸鈉法,用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗原HbA1c,然后根據(jù)競爭ELISA原理設(shè)計直接競爭ELISA檢測方法,并對檢測方法的各項反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化;將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成8個濃度梯度,根據(jù)優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行ELISA檢測,以相對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出線性回歸方程及最低檢測限;最后對該方法進(jìn)行穩(wěn)定性、精密度和準(zhǔn)確度考核。
　　結(jié)果：用簡易

3、過碘酸鈉法成功獲得能與HbA1c單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的酶標(biāo)抗原,經(jīng)紫外分光光度法檢測抗原的標(biāo)記率為0.565,克分子比為1.755。確定的最佳實驗條件為:固相載體采用紫外線照射過的美國Costar酶標(biāo)板;單抗用0.05M pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋成Ⅰ:400包被酶標(biāo)板,150μl/孔,4℃24h;PBST洗滌3次,3min/次;2％BSA封閉,200μl/孔,37℃2h;洗滌;酶標(biāo)抗原1:40與系列稀釋的被檢測物溶液各75μ

4、l,在板內(nèi)競爭反應(yīng);37℃溫育2h;洗滌;加入新混合的TMB底物A液和B液,150μl/孔,室溫放置30min,立即每孔滴加50μl/孔2M H2SO4終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀讀取各孔OD450nm值。根據(jù)上述實驗步驟得出標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合的線性回歸方程為y=37.823x-26.833(R2=0.9802),最低檢測限為16μg/ml,檢測范圍為16~1024μg/ml。通過評價實驗得出該方法能在4℃下穩(wěn)定存放6個月;板內(nèi)和板間變異系數(shù)分別為2