姜黃素影響HaCaT細(xì)胞增殖的靶點(diǎn)及對(duì)TPA誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型的作用研究.pdf

1、尋常型銀屑病是一種常見的慢性皮膚病，臨床表現(xiàn)為與周圍皮膚界限分明的紅色隆起，表面常帶有白色小半鞘翅。因其發(fā)病部位常分布在全身各處且伴隨劇烈瘙癢，嚴(yán)重影響外觀和患者的生活質(zhì)量。銀屑病又極易反復(fù)發(fā)作，因此給患者帶來極大的生理、心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管銀屑病在我國(guó)的發(fā)病率較歐美地區(qū)低，但總體患病人數(shù)較多。長(zhǎng)期以來人們認(rèn)為銀屑病是一種免疫細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病，但銀屑病具體的發(fā)病機(jī)制還不甚清楚，目前主要認(rèn)為是以IL-23、IL-17A、IL-17

2、F、IL-22、TNF-α、IFN-γ、IL-1β等IL-23/IL-17/IL-22細(xì)胞因子軸為中心、固有免疫細(xì)胞和活化的T細(xì)胞參與、功能失調(diào)的角質(zhì)形成細(xì)胞共同作用的結(jié)果。目前針對(duì)尋常型銀屑病的治療主要集中免疫抑制劑（如:環(huán)孢菌素、甲氨蝶呤、阿維A、他克莫司等）、激素治療（丙酸倍他米松、維A酸類、丙酸氯倍他索等）、窄譜光照射療法等，由于其副作用及不良反應(yīng)因而限制了其應(yīng)用。針對(duì)銀屑病發(fā)病機(jī)制中較關(guān)鍵的炎癥因子infliximab、eta

3、nercept、adalimumab等生物制劑由于其靶向性更強(qiáng)等取得了很好的臨床療效，但由于其價(jià)格昂貴且停藥后易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)，迫使人們繼續(xù)尋找新的安全、有效、經(jīng)濟(jì)的抗銀屑病藥物。
　　 姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的黃色粉末，由于其抗炎、抗氧化、抗腫瘤等廣泛的藥理活性及安全性等越來越受到人們的關(guān)注。但由于其水溶性較差，口服生物利用度很低等缺點(diǎn)，目前主要用于克羅恩氏病、乳腺癌等的研究。很早也有關(guān)于姜黃素用于銀屑病的臨床研究，可以有效

4、改善銀屑病患者皮損癥狀，但該實(shí)驗(yàn)樣本量小且缺乏有效的對(duì)照等缺點(diǎn)，主要是由于姜黃素口服生物利用度較低。但為姜黃素皮膚局部給藥治療銀屑病提供了理論支持。目前人們對(duì)姜黃素研究的熱點(diǎn)是將其結(jié)構(gòu)改造后增加水溶性進(jìn)而對(duì)其藥效學(xué)進(jìn)行考察，或制成新劑型以改善其生物利用度。
　　 本課題的研究目的是利用姜黃素凝膠，通過經(jīng)皮給藥的方式考察姜黃素對(duì)銀屑病小鼠模型的作用及其機(jī)制。
　　 本課題主要進(jìn)行了以下研究?jī)?nèi)容:
　　 第一部分:姜

5、黃素對(duì)IL-22誘導(dǎo)下角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究
　　 銀屑病時(shí)IL-22大量增加，主要作用為刺激角質(zhì)過度增殖并抑制其分化，最終引起表皮增厚;另一方面還可以刺激角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)產(chǎn)生炎癥因子IL-20，和IL-22發(fā)揮協(xié)同作用，加重皮膚炎癥狀況;同時(shí)上調(diào)抗菌蛋白S100A7、S100A8、S100A9等使銀屑病皮膚抗菌性增強(qiáng)。
　　 1、本部分研究首先考察姜黃素對(duì)IL-22誘導(dǎo)永生化的人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)

6、生長(zhǎng)狀況的影響，分別利用20 ng/ml和100 ng/ml的IL-22刺激HaCaT細(xì)胞2h后，再利用姜黃素刺激。每隔6h通過CCK-8測(cè)活細(xì)胞吸光度，記錄各處理組細(xì)胞吸光度從而記錄細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。無論IL-22是否存在，姜黃素均可以抑制HaCaT的增殖。
　　 2、探討了姜黃素抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制:IL-22與KC上的受體結(jié)合后，主要通過激活JAK-STAT3通路發(fā)揮作用。本研究利用western-blot檢測(cè)了不同處理組STA

7、T3的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)姜黃素不僅強(qiáng)烈抑制了IL-22誘導(dǎo)的STAT3磷酸化，而且?guī)缀跬耆种屏苏＜?xì)胞內(nèi)的磷酸化。
　　 3、周期蛋白是調(diào)控細(xì)胞增殖重要的內(nèi)部因素。本研究利用real-time PCR檢測(cè)了姜黃素作用2h和6h后周期蛋白cyclin D1和cyclin E在各處理組中的表達(dá)。此外還利用western-blot檢測(cè)了姜黃素作用24 h后不同處理組中cyclin D1和cyclin E的變化。結(jié)果顯示，與空白組相比，

8、IL-22對(duì)周期蛋白的影響不顯著，但姜黃素在核酸和蛋白水平上均顯著抑制了IL-22誘導(dǎo)后周期蛋白cyclin D1和cyclin E的表達(dá)。
　　 4、考察了姜黃素對(duì)IL-22誘導(dǎo)的IL-20影響:利用real-time PCR對(duì)姜黃素作用6h后對(duì)IL-20 mRNA的表達(dá)做出檢測(cè);同時(shí)利用ELISA對(duì)姜黃素作用24 h后IL-20的量進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，與空白組相比，姜黃素和IL-22在核酸水平對(duì)IL-22的影響不顯著，但姜

9、黃素在蛋白水平上調(diào)了IL-22誘導(dǎo)下IL-20的表達(dá)。
　　 結(jié)論:姜黃素可以抑制IL-22誘導(dǎo)下HaCaT細(xì)胞的增殖，其作用可能表現(xiàn)為一方面通過抑制STAT3磷酸化，另一方面可能是通過抑制PI3K通路，下調(diào)了周期蛋白Cyclin D1和Cyclin E的表達(dá)。
　　 第二部分:通過IL-17F、IL-17A單用或聯(lián)合IFN-γ、 TNF-α、IL-6刺激角質(zhì)形成細(xì)胞，研究其對(duì)IL-22表達(dá)的誘導(dǎo)作用
　　 在本

10、課題組另一部分實(shí)驗(yàn)——姜黃素對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠的治療作用及其機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，咪喹莫特刺激小鼠時(shí)，在IL-23的誘導(dǎo)下，來源于真皮δγT細(xì)胞的IL-17A、IL-17F表達(dá)上調(diào)，同樣主要來源于δγT細(xì)胞的IL-22表達(dá)明顯上調(diào)，且表達(dá)量是IL-17A和IL-17F的數(shù)十倍甚至百倍。因此，推測(cè)IL-17A或IL-17F是否刺激了其它的細(xì)胞（如KC）產(chǎn)生IL-22，進(jìn)而將炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大？由于此模型中INF-γ、TNF-α、IL-6也高表

11、達(dá)，是否存在IL-17A/IL-17F在INF-γ、TNF-α、IL-6的協(xié)調(diào)作用下刺激KC產(chǎn)生了大量的IL-22的可能？為此本課題進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn):
　　 1、利用real-time PCR考察IL-17A或IL-17F單獨(dú)刺激KC時(shí)，是否引起IL-22基因表達(dá)上調(diào)。結(jié)果顯示，IL-17A和IL-17F單獨(dú)作用時(shí)，IL-22的表達(dá)和空白組相比無差異，均沒有IL-22基因的擴(kuò)增。
　　 2、利用real-time PCR考

12、察IL-17A或IL-17F聯(lián)合INF-γ、TNF-α、IL-6刺激KC時(shí)，是否能夠引起IL-22基因表達(dá)上調(diào)。結(jié)果顯示，以上刺激因素均不能引起IL-22目的基因的擴(kuò)增，不能產(chǎn)生IL-22。
　　 3、利用ELISA分別對(duì)IL-17A、IL-17F聯(lián)合INF-γ、TNF-α、IL-6作用24 h后的KC細(xì)胞上清進(jìn)行收集，檢測(cè)是否有IL-22的產(chǎn)生。結(jié)果顯示，與空白組相比，兩種條件刺激下IL-22的蛋白水平和空白組基本無差異，且量

13、很少，可以認(rèn)為IL-17A、IL-17F聯(lián)合INF-γ、TNF-α、IL-6作用于KC時(shí)，不能引起IL-22的表達(dá)。
　　 結(jié)論:IL-17A或IL-17F單獨(dú)或聯(lián)合INF-γ、TNF-α、IL-6刺激KC不能產(chǎn)生IL-22。
　　 第三部分:姜黃素對(duì)TPA誘導(dǎo)的K14-VEGF銀屑病小鼠模型的影響及作用機(jī)制研究
　　 本部分研究首先比較了野生型和6-8周轉(zhuǎn)基因小鼠生理基線的差異:利用數(shù)碼相機(jī)記錄小鼠耳部皮膚形態(tài)

14、學(xué);數(shù)字測(cè)厚儀測(cè)量并記錄野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠的耳厚;通過HE染色對(duì)兩種小鼠耳部皮膚組織學(xué)特征進(jìn)行比較;采用real-time PCR對(duì)兩種小鼠耳部皮膚中IL-23/IL17/IL-22作用軸上的一系列細(xì)胞因子進(jìn)行了考察，此外，還利用western-blot和免疫組化對(duì)γδT細(xì)胞在兩種小鼠耳部皮膚中的分布、及真皮中的表達(dá)進(jìn)行了考察。
　　 與野生型小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠耳部皮膚自發(fā)產(chǎn)生紅腫、血管明顯、增厚。HE染色發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠由于表

15、皮基底層輕微增殖而增厚、皮下組織增生，同時(shí)伴有部分炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫。Real-time PCR考察結(jié)果顯示，除IL-23外，轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠在其它細(xì)胞因子（如:IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-21、TNF、IL-6、VEGF等）水平上無差異，但western-blot結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因小鼠VEGF表達(dá)明顯增強(qiáng)，真皮中γδT細(xì)胞特異性標(biāo)記物CCR6無明顯差異。免疫組化結(jié)果顯示，γδT細(xì)胞在兩種小鼠耳部皮膚中的分布及表達(dá)

16、無差異。
　　 結(jié)論:由于周齡較小，K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠VEGF表達(dá)明顯增強(qiáng)，但由于缺乏IL-1β的聯(lián)合刺激，真皮中的γδT細(xì)胞并未增殖活化，因此IL-6、TNF、IL-17等還未高表達(dá)，和野生型小鼠相比，6-8周轉(zhuǎn)基因小鼠只出現(xiàn)了輕微的表皮增厚，并未有顯著的組織學(xué)變化，與以往報(bào)導(dǎo)的研究一致。
　　 在對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠比較的基礎(chǔ)上，本課題考察了姜黃素對(duì)TPA誘導(dǎo)的K14-VEGF銀屑病小鼠模型的影響及作用機(jī)制研

17、究。此部分實(shí)驗(yàn)分為5組:轉(zhuǎn)基因小鼠空白對(duì)照組、TPA模型誘導(dǎo)組、姜黃素單獨(dú)作用組、姜黃素治療組、丙酸氯倍他索治療組。各組按以下內(nèi)容進(jìn)行:
　　 1、在實(shí)驗(yàn)的第0、2、4、6、8、10、12天測(cè)量、記錄小鼠耳厚，并對(duì)各處理組小鼠耳部皮膚進(jìn)行炎癥評(píng)分。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的第12天利用數(shù)碼相機(jī)記錄不同處理組間小鼠耳部皮膚的形態(tài)學(xué)差異。通過HE染色對(duì)不同處理組的小鼠耳部皮膚組織學(xué)變化進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，TPA作用于K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠耳部

18、皮膚后，誘導(dǎo)其產(chǎn)生了紅腫、增厚、鱗屑、血管明顯等銀屑病樣癥狀，姜黃素則逆轉(zhuǎn)了上述銀屑病樣癥狀。HE染色表明，TPA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生表皮增厚、水腫、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等，姜黃素和丙酸氯倍他索減輕了以上癥狀。
　　 2、利用免疫組化和western-blot考察不同處理因素對(duì)小鼠耳部皮膚中δγT細(xì)胞的影響，主要采用標(biāo)記CCR6記錄各處理因素對(duì)真皮中δγT的影響;利用western-blot檢測(cè)δγTCR和RORγ來考察δγT整體水平

19、的變化。免疫組化和western-blot結(jié)果表明，TPA促進(jìn)了δγT細(xì)胞的增殖，但真皮中的CCR6+δγT細(xì)胞增殖并不顯著，表皮中的δγT大量增加，姜黃素和丙酸氯倍他索對(duì)TPA誘導(dǎo)的表皮δγT增殖無顯著影響。
　　 3、利用real-time PCR對(duì)各處理組小鼠耳部皮膚中的炎癥因子IL-23、IL-1β、IL-17A、 IL-17F、IL-22、TNF-α、IL-6、IL-21、VEGF等進(jìn)行考察，探明姜黃素的作用機(jī)制。結(jié)果

20、表明TPA并不通過激活I(lǐng)L-23/IL-17/IL-22作用軸誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生銀屑病樣特征，姜黃素也不通過此通路發(fā)揮作用，但姜黃素不能抑制VEGF的高表達(dá)。
　　 4、為進(jìn)一步探明TPA誘導(dǎo)K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生銀屑病的機(jī)制及姜黃素對(duì)其治療機(jī)制，利用real-time PCR對(duì)各處理組小鼠耳部皮膚中炎癥因子IL-12、IL-27、IFN-γ、IL-2、CXCL9、CXCL10的變化進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，TPA誘導(dǎo)下Th

21、1型上游炎癥因子IL-27及下游炎癥因子IFN-γ、及相應(yīng)趨化因子CXCL9、CXCL10高表達(dá)，而姜黃素和丙酸氯倍他索則顯著下調(diào)了TPA誘導(dǎo)的以上炎癥因子的上調(diào)。
　　 結(jié)論:TPA可以誘導(dǎo)短周齡K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)銀屑病樣特征，但這種作用并不依賴于δγT的增殖和激活，此外，IL-23/IL-17/IL-22作用軸上一系列細(xì)胞因子并不參與此炎癥過程。TPA誘導(dǎo)K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)銀屑病樣癥狀是TPA作用于皮

22、膚后，通過激活I(lǐng)L-27/Th1/IFN-γ通路誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了長(zhǎng)期的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，產(chǎn)生大量的IFN-γ、CXCL9、CXCL10等Th1型炎癥因子，與VEGF慢性過表達(dá)造成的血管炎性反應(yīng)相互作用，造成了銀屑病樣癥狀。姜黃素有效減輕銀屑病樣癥狀可能是通過滅活I(lǐng)L-27誘導(dǎo)下Th1的活化和TPA誘導(dǎo)下蛋白激酶C的活化從而發(fā)揮作用，在對(duì)抗TPA作用于K14/VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠時(shí)可以進(jìn)一步誘導(dǎo)VEGF高表達(dá)，但一方面可以通過阻斷VEGF與受體