水生拉恩氏菌HX2細(xì)菌素合成相關(guān)基因分析和皺褶假單胞菌P94初步研究.pdf

1、Rahnella aquatilis HX2產(chǎn)生細(xì)菌素，對多種植物病原細(xì)菌具有平板抑制效果，具有較廣泛的抑菌譜；溫室和大田實驗顯示HX2菌株對由A.vitis K308引起的葡萄根癌病有較好的防治效果。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上系統(tǒng)研究了HX2細(xì)菌素合成相關(guān)基因及細(xì)菌素在HX2防治葡萄根癌病生防機(jī)理中的作用。
　　 通過Tn5插入突變獲得兩株不產(chǎn)生細(xì)菌素的突變體MH15和MH16，Southern雜交表明Tn5在MH15和MH16

2、中都是單拷貝插入。Tn5插入引起HX2細(xì)菌素產(chǎn)生性狀缺失，并對菌株的生長也發(fā)生了影響，兩個突變體在生長曲線的對數(shù)生長期與野生菌株沒有差異，但穩(wěn)定期明顯長于野生菌株，使得突變體菌落直徑在生長40 h后約為野生菌株的兩倍。
　　 構(gòu)建了HX2基因組文庫。利用鳥槍法和反向PCR法分別通過突變體MH15和MH16中克隆到了Tn5插入的側(cè)翼序列，通過側(cè)翼序列設(shè)計引物對構(gòu)建的基因組文庫進(jìn)行篩選，將篩選到的陽性粘粒通過三親雜交驗證功能表明篩選

3、到的陽性粘粒都能互補(bǔ)突變體，使突變體產(chǎn)生細(xì)菌素的能力得到恢復(fù)。將獲得的陽性粘粒進(jìn)行亞克隆獲得2400 bp的葡萄糖脫氫酶基因(gdh)可以互補(bǔ)突變體MH16。從陽性粘粒中獲得一個輔酶吡咯喹啉醌(PQQ)合成基因簇(包括pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、pqqF六個PQQ合成基因(長5374 bp)和一個1038 bp的未知功能的閱讀框ORF-X)可以互補(bǔ)突變體MH15。構(gòu)建了gdh基因缺失載體，HX2的gdh基因缺失菌株

4、HX2Δgdh細(xì)菌素產(chǎn)生的性狀同時缺失。構(gòu)建了gdh和Pqq基因互補(bǔ)載體，通過三親雜交轉(zhuǎn)入突變體后都能使突變體產(chǎn)生細(xì)菌素的性狀得到恢復(fù)，并且突變體生長性狀也恢復(fù)到了野生菌的水平。將PQQ以0.01μM加入到培養(yǎng)基中也可以使MH15產(chǎn)生細(xì)菌素和生長的性狀恢復(fù)到野生菌HX2水平。這些結(jié)果表明gdh基因和Pqq基因簇與HX2細(xì)菌素合成有關(guān)。
　　 溫室檢測突變體和互補(bǔ)菌株在向日葵和葡萄上對A.vitis引起的根癌病的防治效果，實驗結(jié)果

5、表明，不產(chǎn)生細(xì)菌素的菌株(MH15、MH16)在向日葵上對根癌病的防效為28.8～33.3％，在葡萄上對根癌病的防效為77.4～82.1％，產(chǎn)生細(xì)菌素的菌株(HX2、CH15、CH16和MH15+PQQ)在向日葵和葡萄上對根癌病的防效沒有差異，為92.3～100％；大田防效檢測結(jié)果表明，產(chǎn)素缺失突變體對葡萄根癌病的防效由野生菌株(HX2)的80.2％下降到了45.1％(MH15)和55.7％(MH16)；產(chǎn)素缺失突變體在葡萄上對A.vi

6、tis K308引起的根癌病的防效要優(yōu)于在向日葵上對其的防效。這些結(jié)果表明細(xì)菌素在HX2生防機(jī)理中占有重要作用，但并不是其唯一機(jī)理。
　　 從北京地區(qū)土壤中分離出628株細(xì)菌，從中篩選出10株對番茄灰霉病菌有拮抗作用的細(xì)菌，其中P94的拮抗能力最強(qiáng)。生防菌株P(guān)94的抑菌譜實驗結(jié)果表明P94對多種植物病原細(xì)菌和病原真菌有抑制作用。P94在向日葵、番茄和煙草上無致病性。通過Biolog鑒定系統(tǒng)，16S rDNA序列測定，生理生化特征