寒凝血瘀證模型大鼠IL-1β、TNF-α的變化與卵巢功能的關(guān)系及加減溫經(jīng)湯對(duì)其影響.pdf

1、目的：人類的生殖活動(dòng)受內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和免疫調(diào)節(jié)。月經(jīng)病寒凝血瘀證可表現(xiàn)為月經(jīng)過(guò)少、月經(jīng)后期及閉經(jīng)等內(nèi)分泌失調(diào)疾病。本試驗(yàn)通過(guò)分析寒凝血瘀證模型大鼠血清和卵巢組織細(xì)胞因子的變化與卵巢功能的關(guān)系，揭示寒凝血瘀證婦科病的部分發(fā)病機(jī)理，探討加減溫經(jīng)湯的干預(yù)調(diào)節(jié)機(jī)制，為中醫(yī)婦科證候研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：選用動(dòng)情周期正常(4～5天)的健康清潔級(jí)SD雌性大鼠60只，鼠齡3個(gè)月，體重230±20g，隨機(jī)分為6組，每組10只：即正常對(duì)照組(

2、簡(jiǎn)稱為“正常組”)，模型對(duì)照組(簡(jiǎn)稱為“模型組”)，模型加加減溫經(jīng)湯低劑量組(簡(jiǎn)稱為“低劑量組”)，模型加加減溫經(jīng)湯中劑量組(簡(jiǎn)稱為“中劑量組”)，模型加加減溫經(jīng)湯高劑量組(簡(jiǎn)稱為“高劑量組”，低劑量組、中劑量組、高劑量組又合稱為“治療組”)，桃紅四物湯組(簡(jiǎn)稱為“對(duì)照組”)。正常組常規(guī)飼養(yǎng)，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、對(duì)照組大鼠置于0℃～1℃冰水中20分鐘，每日一次，連續(xù)兩周。低劑量組、中劑量組、高劑量組于造模的第一天開始，

3、分別按7.33g、14.66g、29.32g/kg/日(分別相當(dāng)于臨床成人劑量的5倍、10倍、20倍)給予加減溫經(jīng)湯灌胃，每日一次，連用兩周；對(duì)照組按10.83g/kg/日(相當(dāng)于臨床成人劑量的10倍)給予桃紅四物湯灌胃，其它兩組給予同體積的蒸餾水。自造模第一天起，每日定時(shí)進(jìn)行陰道涂片，觀察大鼠動(dòng)情周期變化。末次造模給藥后，禁食8小時(shí)，選擇動(dòng)情間期的大鼠斷頭取血，制備血清，放免法檢測(cè)雌二醇(E2)、孕酮(P)、睪酮(T)、卵泡刺激素(F

4、SH)、黃體生成素(LH)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。無(wú)菌操作剖腹取出同一側(cè)卵巢組織，吸去血跡，稱重后置于4％多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm厚連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察卵巢組織白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、核因子-κB(NF-κB)表達(dá)強(qiáng)度。 結(jié)果： 1大鼠動(dòng)情周期的變化 模型組大鼠動(dòng)情周期延長(zhǎng)、間期延長(zhǎng)，與正常組比

5、較有顯著性差異(均P＜0.01)，經(jīng)加減溫經(jīng)湯治療，中、高劑量組動(dòng)情周期縮短，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.01)；對(duì)照組與模型組比較動(dòng)情周期縮短，但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。各治療組和對(duì)照組動(dòng)情間期皆縮短，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01P＜0.01，P＜0.05)，與正常組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。 2血清生殖激素變化 與正常組相比，模型組血清E2、

6、P、T、FSH、LH均顯著降低(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)。經(jīng)加減溫經(jīng)湯治療后，低劑量組E2有升高趨勢(shì)，但與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，中、高劑量組和對(duì)照組E2升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)。各治療組和對(duì)照組P水平升高，與模型組比較均有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)。各治療組和對(duì)照組的T和FSH水平均高于模型組，

7、除高劑量組外，其余各組與模型組比較均無(wú)顯著性差異。高、中、低劑量組和對(duì)照組LH升高，與模型組比較均有顯著性差異(均P＜0.01)，其中高、中劑量組和對(duì)照組與正常組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 3血清IL-1β、TNF-α結(jié)果 與正常組相比，模型組血清IL-1β降低，TNF-α升高(均P＜0.01)。與模型組比較，加減溫經(jīng)湯中、高劑量組IL-1β升高(均P＜0.01)、TNF-α降低(P＜0.05，P＜0.01)。低

8、劑量組IL-1β有升高趨勢(shì)、TNF-α有降低趨勢(shì)，但與模型組比較均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。對(duì)照組TNF-α水平降低，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)，IL-1β有升高趨勢(shì)，與模型組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 4卵巢組織IL-β、TNF-α、NF-κBP65的表達(dá) 4.1卵巢組織IL-1β蛋白的表達(dá)情況 IL-1β陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞漿內(nèi)，為棕黃色染色。在大鼠卵巢顆粒細(xì)胞、黃體細(xì)胞、卵泡液中均有

9、表達(dá)，在髓質(zhì)血管周圍有少量表達(dá)。與正常組相比，模型組大鼠卵巢中IL-1β表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.01)，灌服加減溫經(jīng)湯后，中、高劑量組IL-1β表達(dá)均低于模型組(P＜0.01，P＜0.01)，且中、高劑量組二者之間比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。低劑量組和對(duì)照組IL-1β表達(dá)與模型組比較雖有減少趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。高劑量組IL-1β表達(dá)水平低于低劑量組和對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.05)。中、高劑量組與正常組比較無(wú)顯著性

10、差異(均P＞0.05)。 4.2卵巢組織TNF-α蛋白的表達(dá)情況 TNF-α陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞漿內(nèi)，在大鼠黃體細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、膜—間質(zhì)細(xì)胞、髓質(zhì)中均有表達(dá)。模型組TNF-α表達(dá)增多，與正常組比較有顯著性差異(P＜0.01)。低、中、高劑量組與對(duì)照組TNF-α表達(dá)均低于模型組(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)，低劑量組與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。高劑量組TNF-α表達(dá)低于低劑量組和對(duì)照

11、組，差異有顯著性(均P＜0.05)；高劑量組與正常組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 4.3卵巢組織NF-κBP65蛋白的表達(dá)情況 NF-κBP65蛋白陽(yáng)性染色定位于胞漿和胞核內(nèi)，主要分布于顆粒細(xì)胞、髓質(zhì)血管和黃體細(xì)胞內(nèi)。正常組大鼠NF-κB表達(dá)較少，多局限于胞漿，偶見(jiàn)細(xì)胞核陽(yáng)性。模型組NF-κB多表達(dá)于胞核，其灰度值與正常組比較顯著降低(P＜0.01)，說(shuō)明NF-KB的表達(dá)較正常組增多。低劑量組NF-κB的表達(dá)量稍有

12、下降，與模型組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；中、高劑量組和對(duì)照組NF-κB的表達(dá)與模型組比較均降低，差異有顯著性(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)，其中中、高劑量組的表達(dá)低于低劑量組和對(duì)照組(均P＜0.05)，低劑量組和對(duì)照組NF-κB表達(dá)均高于正常組，差異有顯著性(P＜0.01，P＜0.01)。中、高劑量組與正常組比較無(wú)顯著性差異。(均P＞0.05) 5卵巢組織IL-β、TNF-α表達(dá)與NF-κB活性相關(guān)性分析

13、 卵巢組織IL-β、TNF-α與NF-κB活性呈正相關(guān)(r=0.523，P＜0.01；r=0.662，P＜0.01)。 結(jié)論： 1寒凝血瘀證模型大鼠血清生殖激素水平低下，卵巢局部IL-1β，TNF-α含量增加，提示細(xì)胞因子的異常改變可能是導(dǎo)致卵巢功能紊亂的重要因素。 2寒凝血瘀證模型大鼠卵巢內(nèi)NF-κB的活化增強(qiáng)，與IL-1β，TNF-α的蛋白表達(dá)顯著正相關(guān)，提示卵巢內(nèi)NF-κB在寒凝血瘀狀態(tài)下可被某些因素