肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的分離及其耐藥性受Akt通路調(diào)節(jié).pdf

1、研究背景和目的：
　　肝癌在全球腫瘤發(fā)病率位于第五位，占腫瘤致死原因的第三位。目前肝癌的治療以手術(shù)、放療、化療等傳統(tǒng)治療方法為主，但治療效果不理想。近些年來(lái)，腫瘤干細(xì)胞理論的提出為腫瘤的研究、治療提供了新的思路。越來(lái)越多的證據(jù)表明腫瘤組織是由不同的異質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和維持腫瘤生長(zhǎng)的是腫瘤細(xì)胞中的極少一部分細(xì)胞，這些細(xì)胞即為“腫瘤干細(xì)胞”。這些細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性:自我更新、分化及體內(nèi)高致瘤等能力。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)認(rèn)為腫瘤干

2、細(xì)胞是腫瘤組織形成、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的原因，也是腫瘤放療、化療失敗的原因，故對(duì)腫瘤的治療應(yīng)針對(duì)腫瘤干細(xì)胞以達(dá)到根除腫瘤的目的。本研究旨在采用無(wú)血清懸浮球培養(yǎng)法從人肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞株中分離肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞，初步探討Akt通路調(diào)節(jié)其對(duì)化療藥物阿霉素的敏感性。
　　方法：
　　1.將人肝癌細(xì)胞株P(guān)LC、HepG2、Hep3B置于無(wú)血清條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成細(xì)胞球，選用PLC細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.采用流式細(xì)胞術(shù)、克隆形成實(shí)驗(yàn)

3、、誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)、SCID小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)鑒定PLC細(xì)胞球（肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞）的腫瘤干細(xì)胞特性。
　　3.MTT法、流式細(xì)胞儀測(cè)定PLC細(xì)胞球?qū)熕幬锇⒚顾氐拿舾行浴?br>　　4.流式細(xì)胞術(shù)分析加入PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002、阿霉素共同孵育細(xì)胞球后，其凋亡率的變化。
　　5.Western blot法比較PLC細(xì)胞球、PLC貼壁細(xì)胞中P-AKT1S473蛋白分子表達(dá)量及加入抑制劑LY294002作用于

4、細(xì)胞球后，P-AKT1S473、AKT1蛋白分子表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果：
　　1.三株人肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞株在無(wú)血清條件培養(yǎng)基中均可以形成三維、立體的細(xì)胞球。
　　2.肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD90在細(xì)胞球中的表達(dá)較貼壁細(xì)胞顯著升高(P＜0.01)。
　　3.PLC細(xì)胞球經(jīng)含血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化后，可形成梭形、拉伸的非肝細(xì)胞樣細(xì)胞。
　　4.細(xì)胞球的克隆形成數(shù)目（123.00±28.48）為貼壁細(xì)胞(56.33±7

5、.37)的2.18倍(P＜0.05)。
　　5.同樣細(xì)胞數(shù)接種于SCID小鼠皮下7周后，細(xì)胞球的致瘤率明顯大于貼壁細(xì)胞。
　　6.以5μg/ml的阿霉素分別處理細(xì)胞球和貼壁細(xì)胞48h后，細(xì)胞球的增殖率（71.83±12.3）％明顯高于貼壁細(xì)胞[(45.68±5.95)％(P＜0.05)]，凋亡率（11.73±3.77）％顯著低于貼壁細(xì)胞[（41.22±6.73）％(P＜0.01)]，而以阿霉素5μg/ml和LY294002共

6、同孵育細(xì)胞球后，其凋亡率(35.44±6.65)％顯著增加(P＜0.01)。
　　7.Western blot檢測(cè)到細(xì)胞球的P-AKT1S473蛋白分子表達(dá)量顯著高于貼壁細(xì)胞(P＜0.01)，加入抑制劑LY294002處理細(xì)胞球后，P-AKT1S473蛋白表達(dá)量明顯降低(P＜0.05)，AKT1的表達(dá)量無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論:
　　無(wú)血清懸浮球培養(yǎng)法可以從人肝癌細(xì)胞株中有效富集肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞（細(xì)胞球），肝癌干細(xì)胞樣細(xì)