CYP3A5和MDR1基因型及單倍型與環(huán)孢素A在腎移植病人中藥物濃度的相關(guān)性研究.pdf

1、本研究擬以中國(guó)人群為基礎(chǔ)，用PCR-RFLP技術(shù)分析CYP3A5和MDR1的基因型在健康漢族、維吾爾族和哈薩克族人中的分布狀況；在此基礎(chǔ)上，對(duì)早期和穩(wěn)定期腎移植病人的CYP3A5和MDR1基因多態(tài)性及環(huán)孢素A血藥濃度的相關(guān)性進(jìn)行研究，以期探討CYP3A5和MDR1的多態(tài)性對(duì)環(huán)孢素A應(yīng)用的影響，旨在提高環(huán)孢素A的療效，降低毒副反應(yīng)，為制定合理的個(gè)體化給藥方案提供理論依據(jù)。 第一部分細(xì)胞色素CYP3A5基因型研究。 不同地區(qū)

2、、不同種族的CYP3A的活性分布差異很大，就中國(guó)人群而言其主要的遺傳學(xué)因素是CYP3A5*3等位基因突變。中國(guó)是個(gè)多民族的國(guó)家，共有56個(gè)民族，其中漢族人口有11.6億，占總?cè)丝诘?1.59％，而維吾爾族總?cè)丝诠灿?60萬(wàn)，哈薩克族總?cè)丝诠灿?10萬(wàn)。與漢族不同，維吾爾族和哈薩克族屬于高加索人種。健康人群中該基因突變的分布是研究CYP3A5基因型與藥物代謝關(guān)系的基礎(chǔ)。在本研究中采取PCR-RFLP的方法檢測(cè)漢族、維吾爾族和哈薩克族CYP

3、3A5*3的基因型。 目的： 研究健康漢族、維吾爾族和哈薩克族CYP3A5的基因多態(tài)性，并與其他種族進(jìn)行比較，明確種族差異。 方法： 用PCR-RFLP的方法檢測(cè)漢族、維吾爾族和哈薩克族CYP3A5*3等位基因突變位點(diǎn)的分布情況。計(jì)算各民族基因型頻率，并驗(yàn)證是否符合Hardy-Weinberg平衡。用x2檢驗(yàn)比較漢族、維吾爾族和哈薩克族以及已報(bào)道的其他民族的基因型頻率和等位基因頻率。 結(jié)果：

4、 CYP3A5*3在漢族、維吾爾族和哈薩克族三個(gè)民族中最常見(jiàn)的基因型是*3/*3，頻率依次為漢族(50.4％)、維吾爾族(76.1％)和哈薩克族(70.9％)。經(jīng)檢驗(yàn)，這些基因型均符合Hardy-Weinberg平衡。漢族木*1/*1與*1/*3基因型總和的頻率(49.5％)顯著高于維吾爾族(23.9％)和哈薩克族(28.9％)；而后兩者之間沒(méi)有差異。CYP3A5*3在漢族中的發(fā)生頻率顯著低于美國(guó)高加索人、荷蘭人和西班牙人(P<0.0

5、5)，高于美國(guó)黑人(P<0.05)；而在維吾爾族和哈薩克族中的發(fā)生頻率則顯著高于漢族人、日本人和美國(guó)黑人(P<0.05)，與美國(guó)高加索人、荷蘭人和西班牙人相比沒(méi)有顯著性差異。 結(jié)論： 漢族、維吾爾族和哈薩克族的CYP3A5*3基因型頻率有明顯的種族差異。漢族的發(fā)生頻率與其他亞洲人相似，與高加索人差異顯著；而維吾爾族和哈薩克族的發(fā)生頻率介于亞洲人和高加索人之間，更接近高加索人的頻率。 第二部分多藥耐藥基因的基因型研

6、究。 藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體P糖蛋白(P-gp)是多藥耐藥基因(multidrugresistance1，MDR1)的產(chǎn)物。不同地區(qū)、不同種族的P-gp的活性分布差異很大，目前報(bào)道的主要遺傳學(xué)因素是MDR1等位基因突變，常見(jiàn)的突變位點(diǎn)為C1236T、G2677T/A和C3435T。健康人群中MDR1基因突變的分布是研究MDR1基因型與藥物代謝關(guān)系的基礎(chǔ)。在本研究中采取PCR-RFLP的方法檢測(cè)漢族、維吾爾族和哈薩克族MDR1的基因型。

7、 目的： 研究健康漢族、維吾爾族和哈薩克族MDR1的基因多態(tài)性，并與其他種族進(jìn)行比較，明確種族差異。 方法： 用PCR-RFLP的方法檢測(cè)漢族、維吾爾族和哈薩克族MDR1等位基因突變位點(diǎn)的分布情況。用PHASEV2.1軟件對(duì)三個(gè)突變位點(diǎn)MDR11236-2677-3435進(jìn)行單倍體型分析。計(jì)算各民族基因型頻率，并驗(yàn)證是否符合Hardy-Weinberg平衡。用x2檢驗(yàn)比較漢族、維吾爾族和哈薩克族以及已報(bào)道的其他

8、民族的基因型頻率和等位基因頻率。 結(jié)果： 1.漢族MDR1C1236T、G2677T/A和C3435T發(fā)生頻率和MDR11236-2677-3435單倍體型的發(fā)生頻率在男性和女性之間無(wú)顯著性差異。 2.漢族的MDR1基因型和單倍體型分布與高加索人相比有顯著差異，就MDR1-1236而言，漢族TT基因型(48.4％)顯著高于高加索人(16.4％，P<0.01)；等位基因T在漢族人群中的頻率(66.0％)也顯著高于高

9、加索人(41.0％，P<0.01)。就MDR1-2677而言，漢族GG基因型(51.6％)顯著高于高加索人(30.9％P<0.01)。漢族中最常見(jiàn)的單倍體型依次是單倍型CGC，發(fā)生頻率為24.7％；單倍型TGC，發(fā)生頻率為22.7％；單倍型TTT，發(fā)生頻率為22.2％；以及單倍型TGT，發(fā)生頻率為16.2％。其余單倍型TTC、CGT、CAC、CTC、CTT和TAC的發(fā)生頻率均少于5％。高加索人中最常見(jiàn)的單倍體型是單倍型CGC、TTT和C

10、GT，頻率分別為38.2％、41.4％和12.8％，其余單倍型TTC、TGC、TGT、CAC、CTC、CTT和TAC的頻率均小于5％。 3.MDR1-3435在漢族、維吾爾族和哈薩克族中基因型分布有顯著差異。漢族CC基因型的頻率(21.1％)顯著高于維吾爾族(6.8％，P<0.01)和哈薩克族(9.1％，P<0.01)。而后兩者之間沒(méi)有差異(P=0.412)。MDR1C3435T的T基因在漢族中的發(fā)生頻率顯著低于美國(guó)高加索人(P

11、<0.05)，高于美國(guó)黑人(P<0.05)；而T基因在維吾爾族和哈薩克族中的發(fā)生頻率則顯著高于漢族人、日本人、韓國(guó)人和美國(guó)黑人(P<0.05)，與美國(guó)高加索人相比則沒(méi)有顯著性差異。 結(jié)論： 漢族的MDR1C1236T和G2677T/A基因型和單倍體型分布與高加索人相比有顯著差異，而男性和女性之間沒(méi)有差異。漢族、維吾爾族和哈薩克族的MDR1-3435基因型頻率有明顯的種族差異，維吾爾族和哈薩克族的發(fā)生頻率介于漢族和高加索人

12、之間，更接近高加索人的頻率。 第三部分，全血中環(huán)孢素A的HPLC分析方法的建立和腎移植病人藥動(dòng)學(xué)的研究。 免疫抑制劑環(huán)孢素A是是一種作用很強(qiáng)的高效免疫抑制藥。但環(huán)孢素A有效治療閾值窄，口服吸收不完全，代謝個(gè)體差異大，因此，在進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究時(shí)需要建立靈敏度和特異性較高的分析方法來(lái)檢測(cè)環(huán)孢素A的全血濃度。地爾硫卓能抑制肝臟CYP3A酶，競(jìng)爭(zhēng)性抑制環(huán)孢素A的代謝。隨著對(duì)P-gp研究的深入，發(fā)現(xiàn)地爾硫卓和環(huán)孢素A一樣是P-gp的

13、底物，地爾硫卓可能是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制P-gp的原理增加了環(huán)孢素A的吸收。 目的： 建立靈敏度和特異性較高的HPLC法檢測(cè)環(huán)孢素A濃度，并進(jìn)行驗(yàn)證；用自身對(duì)照的方法研究地爾硫卓在腎移植病人中對(duì)環(huán)孢素A谷濃度、達(dá)峰時(shí)間、峰濃度和AUC0-12的影響。 方法： 建立環(huán)孢素A的王HPLC液相方法和全血樣本萃取方法，進(jìn)行全面的方法學(xué)驗(yàn)證；用兩種方法測(cè)定38例病人60人次的全血環(huán)孢素A濃度兩次，一次用本實(shí)驗(yàn)建立的HPL

14、C法，另一次用中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科采用的FPIA法；繪制20例病人25人次的藥時(shí)曲線；測(cè)定5例自身對(duì)照病人合用地爾硫卓前后的環(huán)孢素A的12小時(shí)內(nèi)的藥時(shí)曲線，分析合用地爾硫卓前后環(huán)孢素A的藥動(dòng)學(xué)差異。 第四部分，細(xì)胞色素P4503A5的基因型和多藥耐藥基因的基因型及單倍體型在極早期腎移植病人中與環(huán)孢素A濃度相關(guān)性的研究。環(huán)孢素A是目前臨床上使用最為廣泛的免疫抑制劑之一，也是臨床上需要常規(guī)進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)的藥物之一。環(huán)孢素A不

15、僅要被CYP3A代謝，同時(shí)又是P-gp的底物，CYP3A5和MDR-1的基因多態(tài)性可能會(huì)導(dǎo)致服用相同劑量環(huán)孢素A在不同個(gè)體間產(chǎn)生極大的濃度差異，從而使有的病人因?yàn)榄h(huán)孢素A的血藥濃度過(guò)低引起急性排斥反應(yīng)，而有的病人則因濃度過(guò)高產(chǎn)生不良反應(yīng)。 目的： 旨在研究處于腎移植術(shù)后早期病人的CYP3A5和MDR1基因多態(tài)性對(duì)不同個(gè)體口服環(huán)孢素A出現(xiàn)藥物代謝差異的影響，以期為病人在移植后剛開(kāi)始給藥時(shí)提供指導(dǎo)。 方法：

16、采用回顧性研究的方法分析術(shù)后早期病人的血藥濃度情況，用PCR-RFLP的方法檢測(cè)病人CYP3A5*3和MDR1常見(jiàn)等位基因突變位點(diǎn)的基因多態(tài)性，并用PHASEV2.1軟件對(duì)三個(gè)突變位點(diǎn)MDR11236-2677-3435進(jìn)行單倍體型分析，研究基因型和單倍體型在術(shù)后早期對(duì)環(huán)孢素A濃度的影響。 第五部分，細(xì)胞色素P4503A5的基因型和多藥耐藥基因的基因型及單倍體型在穩(wěn)定期腎移植病人中與環(huán)孢素A濃度相關(guān)性的研究。影響腎移植病人穩(wěn)定期

17、環(huán)孢素A濃度的因素有年齡、體重、藥物相互作用、食物等許多非遺傳因素，但是遺傳因素引起的藥物反應(yīng)和處置的個(gè)體差異相比其他因素而言是更為穩(wěn)定和可以預(yù)測(cè)的。因?yàn)榭梢员M量排除或控制生理及病理因素的影響，對(duì)處于腎移植術(shù)后穩(wěn)定期病人的基因型與環(huán)孢素A濃度的關(guān)系的研究可以更為客觀的反應(yīng)出遺傳多態(tài)性與藥物代謝的關(guān)系。 目的： 旨在研究處于腎移植術(shù)后穩(wěn)定期的病人的CYP3A5和MDR1基因多態(tài)性對(duì)不同個(gè)體口服環(huán)孢素A產(chǎn)生藥物代謝差異的影響