以“濁毒”立論論治肝纖維化的理論初探及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝纖維化（HF）是指各種致病因素所引起的肝臟慢性損害和炎癥，是多種慢性肝病共同的病理基礎(chǔ)，是肝臟細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成和降解失衡、導(dǎo)致其過(guò)度沉積的結(jié)果，也是慢性肝炎進(jìn)一步向肝硬化、肝癌發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。中醫(yī)藥治療疾病具有多方位、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，在肝纖維化的預(yù)防和治療方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)觀(guān)察化濁解毒益氣方對(duì)豬血清誘導(dǎo)的HF大鼠的干預(yù)研究，探討肝纖維化的病理機(jī)制，為肝纖維化的治療提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的：以“濁毒”

2、理論為依據(jù)探討其在肝纖維化治療中的地位，探討化濁解毒益氣方對(duì)肝纖維化大鼠的影響及其可能的作用機(jī)制。主要內(nèi)容包括以“濁毒”立論論治肝纖維化的理論初探；化濁解毒益氣方對(duì)肝纖維化大鼠血清AST、ALT、ALB、TP和病理形態(tài)學(xué)的影響；化濁解毒益氣方對(duì)肝纖維化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原和病理形態(tài)學(xué)的影響；化濁解毒益氣方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1表達(dá)的影響；化濁解毒益氣方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TIMP-1表達(dá)的影響。
　　

3、方法：清潔級(jí)Wistar大鼠60只，雄性，體重200～220g。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、秋水仙堿預(yù)防組（簡(jiǎn)稱(chēng)西藥預(yù)防組）、化濁解毒益氣方預(yù)防組（簡(jiǎn)稱(chēng)中藥預(yù)防組）、秋水仙堿治療組（簡(jiǎn)稱(chēng)西藥治療組）、化濁解毒益氣方治療組（簡(jiǎn)稱(chēng)中藥治療組）六組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余各組均采用未滅活的豬血清腹腔注射，每次0.5ml/只，每周兩次，連續(xù)8周。秋水仙堿預(yù)防組和中藥預(yù)防組于造模的同時(shí)給藥，每天上午灌胃一次，每次2m

4、l，連續(xù)12周。秋水仙堿治療組和中藥治療組于造模的第8周末給藥，每天上午灌胃一次，每次2ml，連續(xù)4周。正常對(duì)照組給予等量生理鹽水。各組分別于造模的第8周末、第12周末處死5只大鼠，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，測(cè)定各組大鼠干預(yù)后血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門(mén)冬氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）、透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（CⅣ）水平。其中ALT、AST用賴(lài)氏法測(cè)定；ALB

5、用溴甲酚綠比色法測(cè)定：TP用雙縮脲法測(cè)定；HA、LN、PCⅢ、CⅣ用放射免疫分析法測(cè)定。留取大鼠肝組織，采用蘇木精-伊紅染色和Masson染色（膠原纖維特殊染色法）觀(guān)察肝組織病理形態(tài)學(xué)的變化。采用免疫組化和RT-PCR技術(shù)測(cè)定肝組織。TGF-β1、TIMP-1蛋白和mRNA表達(dá)情況。所得數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)整理，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.化濁解毒益氣方對(duì)肝纖維化大鼠血清AST、ALT、ALB

6、、TP和病理形態(tài)學(xué)的影響
　　 1.1化濁解毒益氣方對(duì)肝纖維化大鼠血清AST、ALT、ALB、TP的影響:與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清ALT、AST升高，ALB、TP降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型對(duì)照組相比，第8周末，西藥預(yù)防組和中藥預(yù)防組各組大鼠血清ALT、AST下降，TP、ALB升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中藥預(yù)防組優(yōu)于西藥預(yù)防組。12周末，各藥物處理組大鼠血清ALT、AST下降，TP、ALB升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中藥

7、預(yù)防組優(yōu)于西藥預(yù)防組，中藥治療組優(yōu)于西藥治療組。但是西藥處理組之間、中藥處理組之間各組大鼠血清指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 1.2化濁解毒益氣方對(duì)肝纖維化大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)的影響:正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，無(wú)變性壞死，無(wú)纖維組織增生。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肝細(xì)胞廣泛脂肪變性、壞死伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織大量增生，個(gè)別動(dòng)物可見(jiàn)假小葉形成。第8周末，各藥物預(yù)防組肝小葉結(jié)構(gòu)受損輕，可見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪變性及

8、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但較模型組顯著減輕。膠原纖維增生較模型組減輕，主要散在于肝血竇和disse間隙內(nèi)，無(wú)假小葉形成，中藥預(yù)防組優(yōu)于西藥預(yù)防組。第12周末，各藥物干預(yù)組肝臟損傷程度均較模型組輕，西藥治療組病理改變與西藥預(yù)防組相似，中藥治療組病理改變與中藥預(yù)防組相似。且中藥預(yù)防組優(yōu)于西藥預(yù)防組，中藥治療組優(yōu)于西藥治療組。
　　 2.化濁解毒益氣方對(duì)肝纖維化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原和病理形態(tài)學(xué)的影響
　　 2.1化濁解毒

9、益氣方對(duì)肝纖維化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原的影響:與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型對(duì)照組相比，第8周末，西藥預(yù)防組和中藥預(yù)防組各組大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中藥預(yù)防組優(yōu)于西藥預(yù)防組。12周末，各藥物處理組大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中藥預(yù)防組優(yōu)于西藥預(yù)防組，中藥治療組優(yōu)于西藥治療組。但是西藥處理組之間

10、、中藥處理組之間各組大鼠血清指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.2化濁解毒益氣方對(duì)肝纖維化大鼠病理形態(tài)學(xué)的影響:正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，無(wú)變性壞死，無(wú)纖維組織增生。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肝細(xì)胞廣泛脂肪變性、壞死伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，綠色纖維組織大量增生，個(gè)別動(dòng)物可見(jiàn)假小葉形成。8周末，各預(yù)防組肝小葉結(jié)構(gòu)受損輕，可見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪變性及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但較模型組顯著減輕。膠原纖維增生較模型組減輕，主要散在于肝

11、血竇和disse間隙，無(wú)假小葉形成。且中藥預(yù)防組優(yōu)于西藥預(yù)防組。12周末，各藥物干預(yù)組肝臟損傷程度均較模型組顯著減輕，且中藥預(yù)防組優(yōu)于西藥預(yù)防組。中藥治療組優(yōu)于西藥治療組。
　　 3.化濁解毒益氣方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1表達(dá)的影響
　　 3.1化濁解毒益氣方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1蛋白表達(dá)的影響:正常組大鼠肝組織見(jiàn)少許TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，模型組大鼠肝組織中表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著高于正常組，表現(xiàn)為不

12、均勻的黃褐色顆粒狀物。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織TGF-β1蛋白表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8周末，與模型對(duì)照組相比，西藥預(yù)防組和中藥預(yù)防組兩組大鼠肝組織TGF-β1蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中藥預(yù)防組優(yōu)于西藥預(yù)防組。12周末，各藥物干預(yù)組大鼠肝組織TGF-β1蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中藥預(yù)防組優(yōu)于西藥預(yù)防組，中藥治療組優(yōu)于西藥治療組。但是西藥預(yù)防組與治療組之間、中藥預(yù)防組和治療組之間各組大鼠肝組織TGF-β1

13、蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.2化濁解毒益氣方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1mRNA表達(dá)的影響:與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織TGF-β1mRNA表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8周末，與模型對(duì)照組相比，西藥預(yù)防組和中藥預(yù)防組兩組大鼠肝組織TGF-β1mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中藥預(yù)防組優(yōu)于西藥預(yù)防組。12周末，各藥物干預(yù)組大鼠肝組織TGF-β1mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中藥預(yù)防組優(yōu)于西藥預(yù)防

14、組，中藥治療組優(yōu)于西藥治療組。但是西藥預(yù)防組與治療組之間、中藥預(yù)防組和治療組之間各組大鼠肝組織TGF-β1 mRNA表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.化濁解毒益氣方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TIMP-1表達(dá)的影響
　　 4.1化濁解毒益氣方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TIMP-1蛋白表達(dá)的影響:正常組大鼠肝組織見(jiàn)少許TIMP-1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，模型組大鼠肝組織中表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著高于正常組，表現(xiàn)為不均勻的黃褐色顆粒狀物。與正常對(duì)照

15、組相比，模型組大鼠肝組織TIMP-1蛋白表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8周末，與模型對(duì)照組相比，西藥預(yù)防組和中藥預(yù)防組兩組大鼠肝組織TIMP-1蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中藥預(yù)防組優(yōu)于西藥預(yù)防組。12周末，各藥物干預(yù)組大鼠肝組織TIMP-1蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中藥預(yù)防組優(yōu)于西藥預(yù)防組，中藥治療組優(yōu)于西藥治療組。但是西藥預(yù)防組與治療組之間、中藥預(yù)防組和治療組之間各組大鼠肝組織TIMP.1蛋白表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

16、r>　　 4.2化濁解毒益氣方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TIMP-1mRNA表達(dá)的影響:與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織TIMP-1mRNA表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8周末，與模型對(duì)照組相比，西藥預(yù)防組和中藥預(yù)防組大鼠肝組織TIMP-1mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中藥預(yù)防組優(yōu)于西藥預(yù)防組。12周末，各藥物干預(yù)組大鼠肝組織TIMP-1mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中藥預(yù)防組優(yōu)于西藥預(yù)防組，中藥治療組優(yōu)于西藥治療組。但是西

17、藥預(yù)防組與治療組之間、中藥預(yù)防組和治療組之間各組大鼠肝組織TIMP-1mRNA表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1.“濁毒”理論的提出對(duì)肝纖維化的中醫(yī)病因病機(jī)分析具有重要意義，在肝纖維化的診斷和治療中，占有重要的地位。
　　 2.化濁解毒益氣方能有效改善肝纖維化大鼠肝組織病理改變、減輕肝細(xì)胞的損傷，減少膠原纖維的生成，從而發(fā)揮其抗纖維化的作用。
　　 3.化濁解毒益氣方能顯著降低大鼠血清AST

18、、ALT含量，升高TP、ALB含量，減輕肝細(xì)胞的損傷，保護(hù)肝功能，通過(guò)保肝、抗炎而發(fā)揮其抗纖維化的作用。
　　 4.化濁解毒益氣方能顯著降低大鼠血清HA、LN、PCⅢ型膠原、Ⅳ型膠原含量，減少細(xì)胞外基質(zhì)的生成，從而發(fā)揮其抗纖維化的作用。
　　 5.化濁解毒益氣方能顯著降低大鼠肝組織TGF-β1蛋白和mRNA的表達(dá)，抑制肝星狀細(xì)胞的活化，通過(guò)調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子生物作用，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解。
　　 6.化濁解毒益氣方